呂 娜，郭建榮，金孝岠，蘇永俊，劉 洋

(1皖南醫(yī)學(xué)院，安徽蕪湖241000;2上海市浦東新區(qū)公利醫(yī)院)

蛛網(wǎng)膜下腔阻滯后有部分病例會發(fā)生局麻藥脊髓神經(jīng)毒性，臨床表現(xiàn)為短暫性神經(jīng)功能障礙(TNS)［1］、馬尾綜合征(CES)［2］、延遲性骶神經(jīng)感覺障礙和格林—巴利綜合癥(GBS)等，尤其以TNS更為多見。TNS出現(xiàn)在椎管內(nèi)麻醉作用消失、神經(jīng)功能完全恢復(fù)后的24 h內(nèi)，通常在5 d內(nèi)自然消失。CES發(fā)病率雖較TNS低，但預(yù)后多為永久性神經(jīng)運動與感覺功能障礙，給患者造成終身痛苦。國內(nèi)外目前已有將左旋布比卡因用于蛛網(wǎng)膜下腔阻滯的臨床報道［3］，但尚缺乏這方面的基礎(chǔ)理論研究。我們將不同濃度和劑量的鹽酸布比卡因和鹽酸左旋布比卡因分別注入犬蛛網(wǎng)膜下腔，觀察在不同濃度和劑量下局麻藥物對犬脊髓、神經(jīng)根超微結(jié)構(gòu)和腦脊液(CSF)生化方面的影響，為臨床合理用藥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與藥品 原子吸收分光光度計(日本)、JEM-1200EX透射電鏡(日本)、IL1620血氣分析儀(意大利)、AVL9130離子分析儀(美國)、超聲細胞破碎機(德國UP200H)、電動組織勻漿機(德國DIAX-900)、可見分光光度計(法國S500-P)。鹽酸左旋布比卡因注射液(產(chǎn)品批號:04121032，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn))，鹽酸布比卡因注射液(產(chǎn)品批號:H31022839，上海禾豐制藥有限公司生產(chǎn))。

1.2 動物處理 健康雜種犬30只，雌雄不限，犬齡4～6個月，體質(zhì)量10～15 kg，由公利醫(yī)院實驗動物中心提供。將動物隨機分為5組，各6例。動物實驗前禁食水12 h。采用肌注氯胺酮20 mg/kg、阿托品0.05 mg/kg基礎(chǔ)麻醉，開放前肢靜脈，輸注乳酸林格氏液維持體液平衡，氣管插管后接Drager Julia麻醉機行機械控制呼吸，吸入氧濃度100%，調(diào)節(jié)呼吸參數(shù)，維持PETCO2在30～40 mmHg。實驗全程持續(xù)泵注芬太尼、維庫溴銨、間斷吸入低濃度異氟醚維持麻醉。動物置仰臥位固定，頸部切開分離右頸內(nèi)動脈置入20 G套管針，接美國PHILIPS MP60多功能監(jiān)護儀監(jiān)測血液動力學(xué)指標的變化。犬背部除毛、消毒鋪巾，側(cè)臥下于L3～L4間隙切開，切除棘上、棘間韌帶，屈曲位下用尼龍針行蛛網(wǎng)膜下腔穿刺，見清亮CSF流出后，在20 s內(nèi)，C組注入生理鹽水2 mL、L1組注入0.5%左旋布比卡因2 mL、L2組注入0.75%左旋布比卡因2 mL、B1組注入0.5%布比卡因2 mL、B2組注入0.75%布比卡因2 mL。觀察并記錄各組注藥前及注藥后 10、20、30、60、120、180 min 時血液動力學(xué)指標(SBP、DBP、MAP、HR)的變化;檢測注藥前與注藥后1、2、3 h動脈血氣、電解質(zhì)的變化。

1.3 各組CSF中氧分壓(PO2)、乳酸值(Lac)檢測及脊髓、神經(jīng)根組織早期超微結(jié)構(gòu)觀察 觀察注藥前與注藥后1、2、3 h CSF中PO2和Lac的變化;注藥后3 h動脈注射空氣處死動物，暴露椎管切取L1～L2脊髓及馬尾神經(jīng)組織，用去離子水清洗3次，濾紙吸干水分，置于-70℃低溫冰箱保存?zhèn)錂z。采用原子吸收分光光度法測定脊髓組織中Ca2+含量，用黃嘌呤氧化酶法測定脊髓組織中SOD活力，用硫代巴比妥酸法(TBA)法測定脊髓組織中MDA的含量。每組隨機取L1～L2脊髓后角和馬尾神經(jīng)組織，置于3%戊二醛磷酸緩沖液中固定，用透射電鏡觀察脊髓及神經(jīng)根組織超微結(jié)構(gòu)的變化。對神經(jīng)元胞質(zhì)、灰質(zhì)、髓鞘、內(nèi)外軸膜及神經(jīng)根超微結(jié)構(gòu)改變視覺評分，評分標準:0分=無異常改變;1分=非常輕度的改變;2分=輕微的改變;3分=中等程度的改變;4分=有顯著的改變。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件。計量資料以±s表示，采用t檢驗或單因素方差分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

各組動物麻醉時間、術(shù)中輸液和尿量組間比較，P均＞0.05。C組麻醉后血流動力學(xué)比較穩(wěn)定;實驗組有少量動物注藥后5～10 min出現(xiàn)BP降低、HR增快，經(jīng)快速輸液和(或)靜注麻黃堿10～15 mg后BP基本恢復(fù)至基礎(chǔ)值。

椎管內(nèi)注藥后不同時點各組PaO2、PaCO2和pH值比較P均 ＞0.05。各組血漿中 K+、Na+、Cl-注藥前、后組間比較P均＞0.05。

2.1 各組CSF中PO2和Lac值的變化 見表1、2。

表1 各組CSF中Lac的變化(mmol/L，±s)

表1 各組CSF中Lac的變化(mmol/L，±s)

組別3 h C組Lac注藥前 注藥后1 h 注藥后2 h 注藥后1.33 ±0.14 1.34 ±0.16 1.35 ±0.18 1.44 ±0.28 B1組 1.36 ±0.17 1.40 ±0.21 1.43 ±0.23 1.59 ±0.26 B2組 1.34 ±0.12 1.38 ±0.18 1.41 ±0.24 1.67 ±0.25 L1組 1.35 ±0.15 1.39 ±0.17 1.43 ±0.21 1.64 ±0.27 L2組1.37 ±0.19 1.42 ±0.20 1.44 ±0.24 1.57 ±0.29

表2 各組CSF中PO2的變化(mmHg，±s)

表2 各組CSF中PO2的變化(mmHg，±s)

PO2組別3 h C 組 98.63 ±5.23 97.38 ±4.26 97.53 ±4.47 98.47 ±0.44注藥前 注藥后1 h 注藥后2 h 注藥后B1 組 97.52 ±4.35 95.64 ±3.68 95.89 ±4.12 96.74 ±0.49 B2 組 98.78 ±5.86 97.62 ±4.26 97.78 ±4.35 98.34 ±4.56 L1 組 96.83 ±5.75 95.78 ±4.87 96.45 ±4.21 96.55 ±4.78 L2 組 97.82 ±5.63 96.13 ±4.52 96.47 ±4.13 97.45 ±4.35

2.2 脊髓組織中Ca2+、MDA含量和SOD活力的變化 注藥后3 h各組動物脊髓組織中Ca2+、MDA含量及SOD活力變化組間比較P均＞0.05，見表3。

表3 脊髓組織中Ca2+、MDA含量及SOD 活力的變化(±s)

表3 脊髓組織中Ca2+、MDA含量及SOD 活力的變化(±s)

組別 Ca2+(μg/g) MDA(nmol/mg) SOD(NU/mg)C組48.36 ±6.25 5.59 ±0.34 143.83 ±6.87 B1 組 50.32 ±5.67 6.25 ±0.78 138.45 ±5.43 B2 組 52.45 ±5.28 6.78 ±0.86 135.74 ±6.78 L1 組 51.47 ±6.78 6.27 ±0.59 139.36 ±5.87 L2組53.78 ±7.14 6.72 ±0.53 136.89 ±6.64

2.3 脊髓及神經(jīng)根組織超微結(jié)構(gòu)的變化 C組脊髓組織超微結(jié)構(gòu)基本正常，神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)可見結(jié)構(gòu)正常的多個線粒體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，線粒體包膜完整，嵴清晰可見，有髓神經(jīng)纖維的髓鞘完整清晰。B1、L1組脊髓組織神經(jīng)元胞質(zhì)基本接近正常，多數(shù)線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)完整，有髓神經(jīng)纖維的板層結(jié)構(gòu)基本正常。B2、L2組神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)絕大多數(shù)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)清楚，胞質(zhì)內(nèi)可見少量線粒體空泡變性，結(jié)構(gòu)基本正常;神經(jīng)組織有局灶性的輕度水腫，有髓神經(jīng)纖維的板層結(jié)構(gòu)及雪旺氏細胞基本正常，部分有髓神經(jīng)纖維的板層結(jié)構(gòu)疏松。神經(jīng)元胞質(zhì)、灰質(zhì)、髓鞘、內(nèi)外軸膜及神經(jīng)根超微結(jié)構(gòu)改變視覺評分情況如下:①神經(jīng)元胞質(zhì)空泡形成或變性:C、B1、L1組為0分，B2組為2分，L2組為1分;②灰質(zhì)內(nèi)空泡形成:C組為0分，B1、L1、L2組為 1分，B2組為 3分;③髓鞘丟失、斷裂:C、B1、L1組為 0 分，B2、L2組為1 分;④內(nèi)外軸膜清晰程度:C、B1、L1組為0分，B2組為3分，L2組為1分;⑤神經(jīng)根空泡變性:C組為0分，B1、L1組為1分，B2組為3分，L2組為1分。

3 討論

左旋布比卡因是長效酰胺類局麻藥布比卡因的左旋體，與布比卡因相比，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)的毒性更小，而且麻醉效果更佳平穩(wěn)。左旋布比卡因已成功應(yīng)用于硬膜外和外周神經(jīng)阻滯，在腰硬聯(lián)合麻醉方面的應(yīng)用也越來越廣泛，而且獲得了滿意的臨床效果［4］。近年來，對局麻藥毒性的研究越來越多，發(fā)現(xiàn)幾乎所有的局部麻醉藥均存在細胞毒性作用［5］，低濃度時可引起細胞凋亡，而高濃度時以細胞壞死為主要表現(xiàn)。

局麻藥的脊髓神經(jīng)毒性與硬膜外及蛛網(wǎng)膜下腔都存在“易損區(qū)”有關(guān)。硬膜外的易損區(qū)為脊神經(jīng)根硬脊膜處，藥物易于在此區(qū)積聚、沉淀，是發(fā)揮神經(jīng)阻滯的主要部位。而鞘內(nèi)易損區(qū)奧—雷二氏區(qū)為脊神經(jīng)后根入脊髓處，該處神經(jīng)纖維無髓鞘，局麻藥注入蛛網(wǎng)膜下腔后在此處向脊神經(jīng)后根相鄰的脊髓白質(zhì)淺層擴散，而藥物很少或不向遠心端擴散［6］。另外，局麻藥的神經(jīng)毒性也受局麻藥的化學(xué)結(jié)構(gòu)和種類、劑量和濃度、作用時間、比重、局麻藥的 pH值、儲存方式［7］及輔助藥物應(yīng)用等的影響。

局麻藥應(yīng)用于蛛網(wǎng)膜下腔所引起的神經(jīng)系統(tǒng)毒性表現(xiàn)主要以神經(jīng)纖維和脊髓初級神經(jīng)元的損傷為主，其所引起脊髓神經(jīng)毒性的機制仍不是十分清楚，可能有以下幾方面機制:①神經(jīng)細胞凋亡學(xué)說。細胞凋亡包括信號傳導(dǎo)、基因調(diào)控和凋亡效應(yīng)執(zhí)行三個階段。信號傳導(dǎo)的激活是啟動凋亡的前提，絲裂原激活蛋白激酶(MAPK)是凋亡信號傳導(dǎo)的重要通路之一，而c-Jun氨基末端激酶(JNK)屬于MAPK家族成員，在腦缺血缺氧致神經(jīng)細胞凋亡中起重要調(diào)控作用［8］。②線粒體介導(dǎo)的細胞凋亡。線粒體釋放細胞色素C(Cyt C)觸發(fā)caspase級聯(lián)反應(yīng)，啟動內(nèi)源性凋亡途徑是線粒體介導(dǎo)內(nèi)源性凋亡通路的重要環(huán)節(jié)。Onizuka等［9］發(fā)現(xiàn)線粒體跨膜電勢衰減是觸發(fā)Cyt C釋放，誘導(dǎo)凋亡的重要因素，其受胞內(nèi)質(zhì)子電化學(xué)梯度即胞內(nèi)pH值得影響。③局麻藥自身神經(jīng)毒性學(xué)說。局麻藥可直接作用于細胞膜，Kitagawa等發(fā)現(xiàn)，局麻藥與一種常見的表面活性物質(zhì)即十二烷基三甲基氯化銨類似，具有分子聚集作用。這種類去污劑的特性在一定濃度時具有的增溶作用，即在細胞外液滲透壓力尚不足以影響神經(jīng)元細胞膜時，可提高局麻藥表面活性物質(zhì)聚集比例，導(dǎo)致神經(jīng)細胞膜結(jié)構(gòu)不可逆性破壞。④神經(jīng)局部缺血和血—神經(jīng)屏障破壞。局麻藥本身具有對神經(jīng)血管張力調(diào)節(jié)的能力，局麻藥的神經(jīng)毒性與脊神經(jīng)局部缺血相關(guān)［10］。長時間暴露于高濃度局麻藥可引起血供減少，同時加入腎上腺素等縮血管藥物可進一步延長脊神經(jīng)與局麻藥的接觸時間，使血流進一步減少。⑤谷氨酸濃度、AMPA受體和NMDA受體活性改變。局麻藥導(dǎo)致脊髓神經(jīng)系統(tǒng)興奮性氨基酸谷氨酸的釋放增加，過度激活NMDA受體，使細胞內(nèi)Ca2+濃度增加，引起神經(jīng)細胞損害。研究［11］發(fā)現(xiàn)，小鼠鞘內(nèi)注射利多卡因后，CSF中谷氨酸含量呈濃度依賴性增加，過度活化的谷氨酸受體介導(dǎo)神經(jīng)損傷。⑥有研究發(fā)現(xiàn)，局麻藥可干擾親神經(jīng)因子的軸突傳遞，使細胞體中缺乏親神經(jīng)因子，引起延遲性神經(jīng)損害。這種情況被認為是在細胞核斷裂過程中酶作用所致，可能是神經(jīng)延遲損傷的作用機制。⑦此外，局麻藥誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性與p53基因的活化、蛋白激酶B(PKB)表達上調(diào)［12］、炎性反應(yīng)等有關(guān)。

CSF中Lac水平的升高是嚴重脊髓損傷的可靠指標，CSF中Lac濃度可以反映脊髓的代謝平衡。此外，Ishizaki等在動物實驗中研究發(fā)現(xiàn)，CSF中PO2與脊髓組織中的PO2有良好的相關(guān)性，故此CSF中PO2可作為脊髓組織缺血程度的監(jiān)測指標。本研究從CSF中Lac值、PO2檢測結(jié)果來推測脊髓及神經(jīng)根組織損傷的程度，結(jié)果顯示，臨床常用濃度的布比卡因、左旋布比卡因?qū)顾杓吧窠?jīng)根組織未造成明顯的缺血缺氧性損害。

細胞內(nèi)鈣超載是許多細胞損傷的主要原因，具有去污性質(zhì)的局麻藥可能增加了神經(jīng)細胞軸漿內(nèi)的Ca2+含量而損傷神經(jīng)細胞。局麻藥神經(jīng)毒性大小與細胞內(nèi)Ca2+含量呈依賴關(guān)系［13］。鄧小明等報道顯示增加的Ca2+主要集聚在線粒體內(nèi)，引起線粒體損傷及功能障礙。細胞內(nèi)鈣超載激活了各種酶，破壞細胞結(jié)構(gòu)，最終引起細胞死亡。本研究結(jié)果顯示，各組動物脊髓組織中Ca2+含量無顯著差異，提示蛛網(wǎng)膜下腔注入臨床相關(guān)濃度和劑量的布比卡因、左旋布比卡因?qū)顾杞M織損傷輕微。

目前多數(shù)研究認為，神經(jīng)損傷后神經(jīng)元變性壞死是由于在缺氧條件下自由基介導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)所致。因此，檢測MDA?？煞从硻C體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，間接地反映出神經(jīng)細胞損傷的程度。SOD是體內(nèi)重要的抗氧化酶，是清除自由基的主要途徑。結(jié)果證實，實驗各組MDA、SOD水平與生理鹽水對照組無顯著性差異，說明各組氧化與抗氧化程度相似，從一個側(cè)面也可說明臨床常用濃度的布比卡因、左旋布比卡因并未對脊髓組織造成直接的氧化損傷。

既往的研究顯示，不同濃度和劑量的重比重布比卡因注入蛛網(wǎng)膜下腔后，72 h的脊髓組織病理切片顯示，隨著濃度和劑量增加，布比卡因使脊髓組織壞死的發(fā)生率也隨之增加。本研究電鏡結(jié)果顯示，濃度為0.5%和0.75%的布比卡因、左旋布比卡因組，其脊髓組織神經(jīng)元胞質(zhì)和有髓神經(jīng)纖維的板層結(jié)構(gòu)多數(shù)都基本接近正常，提示常用濃度和劑量的布比卡因、左旋布比卡因鞘內(nèi)注射對犬脊髓、神經(jīng)根組織超微結(jié)構(gòu)無顯著影響，但也顯示出隨著局麻藥濃度升高，神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以及神經(jīng)根有髓神經(jīng)纖維髓鞘的板層結(jié)構(gòu)均發(fā)生不同程度的改變，提示隨著局麻藥濃度增加，其對脊髓神經(jīng)系統(tǒng)的毒性作用有增強趨勢。

綜上所述，局麻藥誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性并非是簡單的一元論，而是多通路或多途徑共同介導(dǎo)的結(jié)果，在神經(jīng)阻滯麻醉中局麻藥的安全性十分重要。與布比卡因比較，相同濃度和劑量的左旋布比卡因?qū)θ顾韬蜕窠?jīng)根超微結(jié)構(gòu)的影響更加輕微。但在高濃度、大劑量情況下是否可造成不可逆的脊髓神經(jīng)功能損害，尚有待于進一步研究證實。

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