劉俊

摘要：目的 觀察穴位埋線對血管性癡呆（vascular dementia，VD）大鼠學習記憶能力和血清抗凋亡因子（Livin）含量的影響，探討穴位埋線對VD大鼠腦缺血性損傷的神經(jīng)保護機制。 方法 將大鼠隨機分成假手術(shù)組、VD模型組、穴位埋線組、尼莫地平組，采用改良Pulsinellis四血管閉塞法（four-vessel occlusion，4-VO）建立VD大鼠模型，2個治療組分別施行穴位埋線和尼莫地平治療，連續(xù)15d，Morris水迷宮檢測各組大鼠學習記憶能力，酶聯(lián)免疫吸附法測定血清Livin含量，制作海馬組織病理切片并進行HE染色，觀察并比較各組大鼠學習能力、血清Livin含量及海馬神經(jīng)元損傷的變化。 結(jié)果 模型組表現(xiàn)出明顯的學習記憶障礙，定位航行試驗、空間探索試驗與假手術(shù)組相比有顯著性差異（P<0.01）；與VD模型組比較，穴位埋線治療后VD大鼠學習記憶能力顯著提高（P<0.05，P<0.01），血清Livin含量升高（P<0.05）。 結(jié)論 穴位埋線可改善VD大鼠學習記憶能力，其機理可能與埋線后提升血清Livin含量，進一步抑制神經(jīng)細胞凋亡有關(guān)。[KG）]

關(guān)鍵詞： 血管性癡呆；穴位埋線；學習記憶能力；抗凋亡因子；凋亡

中圖分類號： R245.0 文獻標志碼 ：A

文章編號 ：1007-2349（2014）01-0059-03

血管性癡呆（vascular dementia，VD）是由一系列腦血管因素（缺血、出血、急慢性缺氧性腦血管病等）導致腦組織損害引起的以認知功能障礙為特征的癡呆綜合征[1]，已成為威脅高齡人群生命的疾病之一。細胞凋亡是血管性認知功能損害重要的病理生理機制，認知功能損害程度與細胞凋亡有著直接的聯(lián)系。目前細胞凋亡在腦血管病發(fā)病機制中受到重視，多種細胞因子作為啟動因素引起缺血性腦損傷。Livin是近年發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein family，IAPs）家族新成員，具有較強的抗凋亡活性。本研究制備VD大鼠模型，采用穴位埋線治療，觀察VD大鼠血清Livin水平，探討穴位埋線治療VD的可能機制，為臨床治療VD提供一定的實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康雄性SD大鼠70只，體重280～300 g，清潔級，由重慶滕鑫比爾實驗動物銷售有限公司提供，許可證號：SCXK（渝）2007-0006。

1.1.2 實驗器材 可吸收性外科縫線（經(jīng)絡疏通專用線）（中國中醫(yī)研究院眾益科技開發(fā)公司）；電子天平（蘇州精密儀器廠）；DigBehv Morris 水迷宮視頻分析系統(tǒng)（上海吉量軟件科技有限公司）；微型動脈夾（安徽淮北正華生物儀器設備有限公司）；SDQ-30雙極射頻電凝器（蘇州手術(shù)器械廠）；一次性1mL注射針頭、一次性5mL注射針頭（江西洪達醫(yī)療器械集團有限公司）。

1.1.3 藥品與試劑 水合氯醛、4%多聚甲醛、兔抗大鼠Livin抗體（美國R&D Systems 公司生產(chǎn)）檢測試劑盒（貴州平生生物技術(shù)有限公司提供）、尼莫地平片（正大青春寶藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號：0801002）。

1.2 方法

1.2.1 VD大鼠模型的建立 將大鼠隨機分為假手術(shù)組、VD模型組、穴位埋線組和尼莫地平組，采用改良的Pulsinellis四血管阻斷法（four-vessel occlusion，4-VO）建立VD大鼠模型[2]。模型制作成功標準：大鼠在4條血管阻斷后1-2 min內(nèi)，翻正反射消失，虹膜變白及瞳孔散大。

1.2.2 治療方法 術(shù)后第7天開始治療，除穴位埋線組外，其余各組治療均在每天上午9：00～11：00進行，每日1次，連續(xù)治療15 d。

1.2.2.1 穴位埋線組 穴位選擇：百會、膈俞、氣海、三陰交、膻中。穴位定位：以《實驗針灸學》定位位置為標準[3]。治療方法：將可吸收性外科縫線（4～0號）剪成2 mm小段若干，放在已消毒紙上備用。使用時用鑷子將其裝入1 mL的注射針頭，然后再將預先剪去針尖的針灸針作為針芯穿入注射針頭內(nèi)，組成一套埋線工具。埋線時，先以碘酒消毒，乙醇脫碘后，將注射針頭刺入穴位，然后抵住針灸針針尾作注射狀，迅速將針頭內(nèi)的羊腸線推入穴內(nèi)，感覺注射針內(nèi)有空虛感時方可出針，并確認羊腸線已埋入穴位內(nèi)。

1.2.2.2 尼莫地平組 按20 mg/（kg·d）的用量進行灌胃治療。

1.2.2.3 假手術(shù)組、VD模型組均給予蒸餾水1 mL/100 g灌胃。

1.2.3 Morris 水迷宮學習記憶能力檢測[4]各組大鼠于術(shù)后第28 d開始水迷宮測試。Morris水迷宮為圓形水池，直徑100 cm，深50 cm，水深30 cm，水溫（24±2）℃，池壁上4個等距離點分水池為四個象限，選第三象限在其中央放置平臺，平臺無色透明，直徑6 cm，高28 cm，平臺沒于水面下2 cm，水池周圍參照物保持不變。第1～6 d進行定向航行實驗，每日將大鼠按Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ象限的順序從各入水點（各象限水池壁中點）靠池壁放入水中，記錄60 s內(nèi)大鼠從水中爬上站臺所需時間為逃避潛伏期；第7 d行空間探索實驗，將大鼠從第Ⅰ象限入水點放入水池，記錄2 min內(nèi)大鼠在第Ⅲ象限游泳時間和穿越站臺次數(shù)。

1.2.4 血清采集及檢測 Morris 水迷宮檢測之后，于腹股溝處切開皮膚，剪斷股動脈采集血液，入冰箱靜置過夜后采集血清以備進行Livin含量檢測。開顱取腦，取海馬組織固定12 h。經(jīng)梯度酒精脫水、透明、浸蠟、包埋后，連續(xù)冠狀切片（片厚5 um）。蘇木素-伊紅（HE）染色，光鏡下觀察海馬神經(jīng)元的病理變化。

1.2.5 圖像分析及統(tǒng)計學處理 用Biomias99圖像分析系統(tǒng)進行圖像分析。實驗數(shù)據(jù)用SPSS12.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，組間差異比較采用SNK檢驗，統(tǒng)計結(jié)果以以表示。endprint

2 結(jié)果

2.1 穴位埋線對VD大鼠Morris水迷宮的影響

2.1.1 定位航行實驗 平均逃避潛伏期反映大鼠的學習能力。模型組大鼠平均逃避潛伏期與假手術(shù)組比較明顯延長（P<0.05或P<0.01），穴位埋線組與模型組相比，平均逃避潛伏期縮短（P<0.01），與尼莫地平組無比較意義（P>0.05）。結(jié)果見表1。

2.1.2 空間探索實驗 該實驗反映了大鼠的記憶能力。VD模型組與假手術(shù)組比較，第Ⅲ象限活動時間縮短、穿越站臺次數(shù)減少（P<0.01），穴位埋線組與VD模型組比較，第Ⅲ象限活動時間延長、穿越站臺次數(shù)增多（P<0.01，P<0.05），穴位埋線組與尼莫地平組無比較意義（P>0.05）。結(jié)果見表2。

2.2 穴位埋線對VD大鼠血清livin含量的影響 VD模型組大鼠血清Livin含量比假手術(shù)組顯著降低（P<0.01），穴位埋線組大鼠血清Livin含量雖然也低于假手術(shù)組（P<0.05），但與VD模型組大鼠相比明顯升高（P<0.05），結(jié)果見表2。穴位埋線可以提升VD大鼠異常降低的血清Livin含量，提示其改善VD大鼠的學習記憶能力與升高其血清Livin含量有關(guān)。

2.3 穴位埋線對VD大鼠病理形態(tài)學的影響 HE染色見假手術(shù)組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元排列整齊、密集，無變性、壞死和腫脹細胞結(jié)構(gòu)正常，胞漿豐富，無膠質(zhì)細胞增生現(xiàn)象；細胞核呈圓形、橢圓形。（見Fig.1圖A）；VD模型組海馬組織明顯水腫，血管擴張充血，并見嚴重的神經(jīng)元腫脹、變性及壞死，神經(jīng)纖維增粗紊亂。（見Fig.1圖B）；穴位埋線組海馬CA1區(qū)現(xiàn)輕微水腫、血管擴張充血，神經(jīng)元出現(xiàn)腫脹及變性，未見神經(jīng)元排列紊亂和壞死。（見Fig.1圖C）；尼莫地平組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元密集，出現(xiàn)輕微水腫和血管擴張充血，神經(jīng)元現(xiàn)輕微腫脹和變性，未見神經(jīng)元排列紊亂和壞死，神經(jīng)纖維現(xiàn)增粗紊亂。（見Fig.1圖D）。

3 討論

近年來的研究表明，腦缺血可引起腦神經(jīng)細胞凋亡及其相關(guān)基因的表達，并認為細胞凋亡在缺血損傷中起重要作用。越來越多的證據(jù)表明：基因調(diào)控與細胞凋亡有關(guān)。影響細胞凋亡的基因按其表達物對凋亡過程的作用大致可分為兩類：存活基因和致死基因。Livin是一種新近發(fā)現(xiàn)的抗細胞凋亡因子，以其為靶點的抑制物及反義Livin能夠保護細胞不進行凋亡[5]。還有報道稱Livin能夠作用于細胞凋亡線粒體通路，發(fā)揮抑制細胞凋亡的作用[6]。抑制凋亡的的機制主要通過：抑制Caspasep途徑、激活TAK1/JNK1信號傳導途徑來實現(xiàn)[5]。譚家澤等[7]通過對Livin檢測顯示VD患者Livin含量降低，提示Livin低表達參與了VD的細胞凋亡進程。張益等[8]對大鼠腦缺血再灌注腦組織Livin表達的研究顯示，假手術(shù)組、正常組Livin陽性細胞數(shù)量極低，模型組Livin陽性細胞數(shù)明顯增加，治療后，Livin陽性細胞數(shù)增加，表明通過增加Livin表達，可對細胞凋亡產(chǎn)生抑制作用，減輕神經(jīng)元的丟失。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組VD大鼠Livin含量降低，與譚家澤的臨床試驗結(jié)果相一致。進一步觀察發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，埋線組可以提升VD大鼠異常降低的血清Livin含量，緩解海馬神經(jīng)元細胞損傷。

穴位埋線療法屬于針灸療法的一個分支，是經(jīng)絡理論與現(xiàn)代醫(yī)學手段相結(jié)合的產(chǎn)物，是在中醫(yī)理論指導下，采用不同型號的羊腸線，根據(jù)需要有選擇地埋入穴位，通過羊腸線對穴位的持續(xù)刺激作用，達到治療疾病的一種外治方法，已經(jīng)廣泛應用于臨床各科[9]。由于VD是一種需要長期治療的疾病，目前針刺療效肯定，而穴位埋線每20～30 d治療1次，故避免需較長時間每日針刺的痛苦，使家屬及患者更能堅持長期的治療，所以穴位埋線不失為一種較為切實的治療方法。中醫(yī)認為，癡呆病人多屬本虛標實，氣虛血瘀。氣虛則神失所養(yǎng)，瘀血則可隨經(jīng)脈流行入腦，與精髓錯雜，致使清竅受蒙，靈機呆鈍而出現(xiàn)神識不清，表情癡呆諸癥。筆者選取百會、膈俞、氣海、三陰交（雙）、膻中組成益氣活血方。百會為諸陽、百脈之會，可開竅醒神、回陽固脫。膈俞有開胸通膈治療氣滯血瘀之功。氣海培補元氣。三陰交可健脾益氣，調(diào)補肝腎。膻中為氣會，有理肺氣、通乳絡之功。以上五穴共同組合，共奏益氣活血之功。本實驗以此為基礎，運用穴位埋線治療實驗性VD大鼠，觀察大鼠血清Livin含量變化與埋線治療的療效關(guān)系，為臨床運用穴位埋線治療VD提供一定的理論依據(jù)。

Morris水迷宮已經(jīng)廣泛地用于動物空間學習記憶研究的實驗?？臻g學習記憶是檢測動物空間方向、反射時間、視知覺和結(jié)構(gòu)應用等能力，從而評價其認知水平的一種行為模式，是一類關(guān)于場景和事件的學習記憶，因能較好地檢測到實驗動物的空間學習記憶功能，并有排除動物在完成作業(yè)而經(jīng)過的途中所留下的排泄物和所分泌的外激素對其它動物作業(yè)成績產(chǎn)生影響等優(yōu)點，因而在國內(nèi)外被廣泛采用[10]。本實驗采用經(jīng)典的4-VO建立VD模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠找到站臺的時間比對照組大鼠明顯延長；第7天撤去站臺后，VD模型組大鼠第Ⅲ象限游泳時間和穿越站臺次數(shù)比對照組明顯減少，結(jié)果表明，模型組大鼠學習記憶能力較對照組明顯減退，應用4-VO改良法成功復制了VD模型大鼠。采用穴位埋線治療后，大鼠找到站臺的時間較VD模型組明顯縮短，學習記憶成績接近對照組，提示穴位埋線能有效改善VD大鼠的學習記憶能力。

結(jié)果顯示，VD模型組血清Livin顯著低于假手術(shù)組，穴位埋線組與VD模型組相比，具有顯著性差異（P<0.01），與尼莫地平組相比，無顯著性差異（P>0.05）。病理結(jié)果顯示，VD模型組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元嚴重受損，導致學習記憶能力降低，穴位埋線組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元恢復良好，無嚴重變性和壞死，說明穴位埋線可緩解腦缺血性損傷的神經(jīng)細胞凋亡，從而改善學習記憶。本研究結(jié)果表明，提升血清Livin含量，緩解腦缺血后細胞凋亡，減輕海馬神經(jīng)元的損傷，可能是穴位埋線改善癡呆癥狀的機理之一。

參考文獻：

[1]李 梨，周岐新，石京山.血管性癡呆研究概況[J].中國老年學雜志，2005；25：1269-1271.

[2]劉 燕，李衛(wèi)東，苗晉，等.電針對血管性癡呆大鼠腦組織MDA和AchE含量的影響[J].天津中醫(yī)藥，2008，25（6）：459-461.

[3]李忠仁.實驗針灸學[M].北京：中國中醫(yī)藥出版社，2003：184-185.

[4]Vorhees CV，W Il1iams M T.M orris water maze：procedures for assessing spatial and related forms of learning and memory.Nat Protoc，2006；1（2）：848-858.

[5]Nachmias B，Ashhab Y，Buchohz V，et a1.Caspase-mediated cleavage conveFts Livin from an antiapoptotic to a proapoptotic factor：implications fordmg-resistantmelanoma[J].CancerRes，2003，63（19）：6340-6349.

[6]梁春艷，馬萍.凋亡抑制蛋白Livin抗癌新靶點[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學，2008，6（16）：1055-1057.

[7]譚家澤，蔡志友.血管性癡呆患者血清Livin、VEGF與IL-18、IFN-γ水平的臨床研究[J].重慶醫(yī)科大學學報，2009，9（34）：1246-1249.

[8]張益，蔡志友，晏勇.阿托伐他汀對大鼠腦缺血再灌注腦組織Livin、caspase 3表達的影響[J].重慶醫(yī)學，2009，9（37）：1112-1114.

[9]蒙珊，呂計寶，文小江.穴位埋線療法臨床應用近況[J].山西中醫(yī)，2012，28（2）：56-58.

[10]柯尊記，姚志彬.空間學習記憶的行為模式及其分子神經(jīng)生物學基礎[J].解剖科學進展，1998，4（1）：1-7.endprint

2 結(jié)果

2.1 穴位埋線對VD大鼠Morris水迷宮的影響

2.1.1 定位航行實驗 平均逃避潛伏期反映大鼠的學習能力。模型組大鼠平均逃避潛伏期與假手術(shù)組比較明顯延長（P<0.05或P<0.01），穴位埋線組與模型組相比，平均逃避潛伏期縮短（P<0.01），與尼莫地平組無比較意義（P>0.05）。結(jié)果見表1。

2.1.2 空間探索實驗 該實驗反映了大鼠的記憶能力。VD模型組與假手術(shù)組比較，第Ⅲ象限活動時間縮短、穿越站臺次數(shù)減少（P<0.01），穴位埋線組與VD模型組比較，第Ⅲ象限活動時間延長、穿越站臺次數(shù)增多（P<0.01，P<0.05），穴位埋線組與尼莫地平組無比較意義（P>0.05）。結(jié)果見表2。

2.2 穴位埋線對VD大鼠血清livin含量的影響 VD模型組大鼠血清Livin含量比假手術(shù)組顯著降低（P<0.01），穴位埋線組大鼠血清Livin含量雖然也低于假手術(shù)組（P<0.05），但與VD模型組大鼠相比明顯升高（P<0.05），結(jié)果見表2。穴位埋線可以提升VD大鼠異常降低的血清Livin含量，提示其改善VD大鼠的學習記憶能力與升高其血清Livin含量有關(guān)。

2.3 穴位埋線對VD大鼠病理形態(tài)學的影響 HE染色見假手術(shù)組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元排列整齊、密集，無變性、壞死和腫脹細胞結(jié)構(gòu)正常，胞漿豐富，無膠質(zhì)細胞增生現(xiàn)象；細胞核呈圓形、橢圓形。（見Fig.1圖A）；VD模型組海馬組織明顯水腫，血管擴張充血，并見嚴重的神經(jīng)元腫脹、變性及壞死，神經(jīng)纖維增粗紊亂。（見Fig.1圖B）；穴位埋線組海馬CA1區(qū)現(xiàn)輕微水腫、血管擴張充血，神經(jīng)元出現(xiàn)腫脹及變性，未見神經(jīng)元排列紊亂和壞死。（見Fig.1圖C）；尼莫地平組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元密集，出現(xiàn)輕微水腫和血管擴張充血，神經(jīng)元現(xiàn)輕微腫脹和變性，未見神經(jīng)元排列紊亂和壞死，神經(jīng)纖維現(xiàn)增粗紊亂。（見Fig.1圖D）。

3 討論

近年來的研究表明，腦缺血可引起腦神經(jīng)細胞凋亡及其相關(guān)基因的表達，并認為細胞凋亡在缺血損傷中起重要作用。越來越多的證據(jù)表明：基因調(diào)控與細胞凋亡有關(guān)。影響細胞凋亡的基因按其表達物對凋亡過程的作用大致可分為兩類：存活基因和致死基因。Livin是一種新近發(fā)現(xiàn)的抗細胞凋亡因子，以其為靶點的抑制物及反義Livin能夠保護細胞不進行凋亡[5]。還有報道稱Livin能夠作用于細胞凋亡線粒體通路，發(fā)揮抑制細胞凋亡的作用[6]。抑制凋亡的的機制主要通過：抑制Caspasep途徑、激活TAK1/JNK1信號傳導途徑來實現(xiàn)[5]。譚家澤等[7]通過對Livin檢測顯示VD患者Livin含量降低，提示Livin低表達參與了VD的細胞凋亡進程。張益等[8]對大鼠腦缺血再灌注腦組織Livin表達的研究顯示，假手術(shù)組、正常組Livin陽性細胞數(shù)量極低，模型組Livin陽性細胞數(shù)明顯增加，治療后，Livin陽性細胞數(shù)增加，表明通過增加Livin表達，可對細胞凋亡產(chǎn)生抑制作用，減輕神經(jīng)元的丟失。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組VD大鼠Livin含量降低，與譚家澤的臨床試驗結(jié)果相一致。進一步觀察發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，埋線組可以提升VD大鼠異常降低的血清Livin含量，緩解海馬神經(jīng)元細胞損傷。

穴位埋線療法屬于針灸療法的一個分支，是經(jīng)絡理論與現(xiàn)代醫(yī)學手段相結(jié)合的產(chǎn)物，是在中醫(yī)理論指導下，采用不同型號的羊腸線，根據(jù)需要有選擇地埋入穴位，通過羊腸線對穴位的持續(xù)刺激作用，達到治療疾病的一種外治方法，已經(jīng)廣泛應用于臨床各科[9]。由于VD是一種需要長期治療的疾病，目前針刺療效肯定，而穴位埋線每20～30 d治療1次，故避免需較長時間每日針刺的痛苦，使家屬及患者更能堅持長期的治療，所以穴位埋線不失為一種較為切實的治療方法。中醫(yī)認為，癡呆病人多屬本虛標實，氣虛血瘀。氣虛則神失所養(yǎng)，瘀血則可隨經(jīng)脈流行入腦，與精髓錯雜，致使清竅受蒙，靈機呆鈍而出現(xiàn)神識不清，表情癡呆諸癥。筆者選取百會、膈俞、氣海、三陰交（雙）、膻中組成益氣活血方。百會為諸陽、百脈之會，可開竅醒神、回陽固脫。膈俞有開胸通膈治療氣滯血瘀之功。氣海培補元氣。三陰交可健脾益氣，調(diào)補肝腎。膻中為氣會，有理肺氣、通乳絡之功。以上五穴共同組合，共奏益氣活血之功。本實驗以此為基礎，運用穴位埋線治療實驗性VD大鼠，觀察大鼠血清Livin含量變化與埋線治療的療效關(guān)系，為臨床運用穴位埋線治療VD提供一定的理論依據(jù)。

Morris水迷宮已經(jīng)廣泛地用于動物空間學習記憶研究的實驗?？臻g學習記憶是檢測動物空間方向、反射時間、視知覺和結(jié)構(gòu)應用等能力，從而評價其認知水平的一種行為模式，是一類關(guān)于場景和事件的學習記憶，因能較好地檢測到實驗動物的空間學習記憶功能，并有排除動物在完成作業(yè)而經(jīng)過的途中所留下的排泄物和所分泌的外激素對其它動物作業(yè)成績產(chǎn)生影響等優(yōu)點，因而在國內(nèi)外被廣泛采用[10]。本實驗采用經(jīng)典的4-VO建立VD模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠找到站臺的時間比對照組大鼠明顯延長；第7天撤去站臺后，VD模型組大鼠第Ⅲ象限游泳時間和穿越站臺次數(shù)比對照組明顯減少，結(jié)果表明，模型組大鼠學習記憶能力較對照組明顯減退，應用4-VO改良法成功復制了VD模型大鼠。采用穴位埋線治療后，大鼠找到站臺的時間較VD模型組明顯縮短，學習記憶成績接近對照組，提示穴位埋線能有效改善VD大鼠的學習記憶能力。

結(jié)果顯示，VD模型組血清Livin顯著低于假手術(shù)組，穴位埋線組與VD模型組相比，具有顯著性差異（P<0.01），與尼莫地平組相比，無顯著性差異（P>0.05）。病理結(jié)果顯示，VD模型組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元嚴重受損，導致學習記憶能力降低，穴位埋線組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元恢復良好，無嚴重變性和壞死，說明穴位埋線可緩解腦缺血性損傷的神經(jīng)細胞凋亡，從而改善學習記憶。本研究結(jié)果表明，提升血清Livin含量，緩解腦缺血后細胞凋亡，減輕海馬神經(jīng)元的損傷，可能是穴位埋線改善癡呆癥狀的機理之一。

參考文獻：

[1]李 梨，周岐新，石京山.血管性癡呆研究概況[J].中國老年學雜志，2005；25：1269-1271.

[2]劉 燕，李衛(wèi)東，苗晉，等.電針對血管性癡呆大鼠腦組織MDA和AchE含量的影響[J].天津中醫(yī)藥，2008，25（6）：459-461.

[3]李忠仁.實驗針灸學[M].北京：中國中醫(yī)藥出版社，2003：184-185.

[4]Vorhees CV，W Il1iams M T.M orris water maze：procedures for assessing spatial and related forms of learning and memory.Nat Protoc，2006；1（2）：848-858.

[5]Nachmias B，Ashhab Y，Buchohz V，et a1.Caspase-mediated cleavage conveFts Livin from an antiapoptotic to a proapoptotic factor：implications fordmg-resistantmelanoma[J].CancerRes，2003，63（19）：6340-6349.

[6]梁春艷，馬萍.凋亡抑制蛋白Livin抗癌新靶點[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學，2008，6（16）：1055-1057.

[7]譚家澤，蔡志友.血管性癡呆患者血清Livin、VEGF與IL-18、IFN-γ水平的臨床研究[J].重慶醫(yī)科大學學報，2009，9（34）：1246-1249.

[8]張益，蔡志友，晏勇.阿托伐他汀對大鼠腦缺血再灌注腦組織Livin、caspase 3表達的影響[J].重慶醫(yī)學，2009，9（37）：1112-1114.

[9]蒙珊，呂計寶，文小江.穴位埋線療法臨床應用近況[J].山西中醫(yī)，2012，28（2）：56-58.

[10]柯尊記，姚志彬.空間學習記憶的行為模式及其分子神經(jīng)生物學基礎[J].解剖科學進展，1998，4（1）：1-7.endprint

2 結(jié)果

2.1 穴位埋線對VD大鼠Morris水迷宮的影響

2.1.1 定位航行實驗 平均逃避潛伏期反映大鼠的學習能力。模型組大鼠平均逃避潛伏期與假手術(shù)組比較明顯延長（P<0.05或P<0.01），穴位埋線組與模型組相比，平均逃避潛伏期縮短（P<0.01），與尼莫地平組無比較意義（P>0.05）。結(jié)果見表1。

2.1.2 空間探索實驗 該實驗反映了大鼠的記憶能力。VD模型組與假手術(shù)組比較，第Ⅲ象限活動時間縮短、穿越站臺次數(shù)減少（P<0.01），穴位埋線組與VD模型組比較，第Ⅲ象限活動時間延長、穿越站臺次數(shù)增多（P<0.01，P<0.05），穴位埋線組與尼莫地平組無比較意義（P>0.05）。結(jié)果見表2。

2.2 穴位埋線對VD大鼠血清livin含量的影響 VD模型組大鼠血清Livin含量比假手術(shù)組顯著降低（P<0.01），穴位埋線組大鼠血清Livin含量雖然也低于假手術(shù)組（P<0.05），但與VD模型組大鼠相比明顯升高（P<0.05），結(jié)果見表2。穴位埋線可以提升VD大鼠異常降低的血清Livin含量，提示其改善VD大鼠的學習記憶能力與升高其血清Livin含量有關(guān)。

2.3 穴位埋線對VD大鼠病理形態(tài)學的影響 HE染色見假手術(shù)組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元排列整齊、密集，無變性、壞死和腫脹細胞結(jié)構(gòu)正常，胞漿豐富，無膠質(zhì)細胞增生現(xiàn)象；細胞核呈圓形、橢圓形。（見Fig.1圖A）；VD模型組海馬組織明顯水腫，血管擴張充血，并見嚴重的神經(jīng)元腫脹、變性及壞死，神經(jīng)纖維增粗紊亂。（見Fig.1圖B）；穴位埋線組海馬CA1區(qū)現(xiàn)輕微水腫、血管擴張充血，神經(jīng)元出現(xiàn)腫脹及變性，未見神經(jīng)元排列紊亂和壞死。（見Fig.1圖C）；尼莫地平組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元密集，出現(xiàn)輕微水腫和血管擴張充血，神經(jīng)元現(xiàn)輕微腫脹和變性，未見神經(jīng)元排列紊亂和壞死，神經(jīng)纖維現(xiàn)增粗紊亂。（見Fig.1圖D）。

3 討論

近年來的研究表明，腦缺血可引起腦神經(jīng)細胞凋亡及其相關(guān)基因的表達，并認為細胞凋亡在缺血損傷中起重要作用。越來越多的證據(jù)表明：基因調(diào)控與細胞凋亡有關(guān)。影響細胞凋亡的基因按其表達物對凋亡過程的作用大致可分為兩類：存活基因和致死基因。Livin是一種新近發(fā)現(xiàn)的抗細胞凋亡因子，以其為靶點的抑制物及反義Livin能夠保護細胞不進行凋亡[5]。還有報道稱Livin能夠作用于細胞凋亡線粒體通路，發(fā)揮抑制細胞凋亡的作用[6]。抑制凋亡的的機制主要通過：抑制Caspasep途徑、激活TAK1/JNK1信號傳導途徑來實現(xiàn)[5]。譚家澤等[7]通過對Livin檢測顯示VD患者Livin含量降低，提示Livin低表達參與了VD的細胞凋亡進程。張益等[8]對大鼠腦缺血再灌注腦組織Livin表達的研究顯示，假手術(shù)組、正常組Livin陽性細胞數(shù)量極低，模型組Livin陽性細胞數(shù)明顯增加，治療后，Livin陽性細胞數(shù)增加，表明通過增加Livin表達，可對細胞凋亡產(chǎn)生抑制作用，減輕神經(jīng)元的丟失。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組VD大鼠Livin含量降低，與譚家澤的臨床試驗結(jié)果相一致。進一步觀察發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，埋線組可以提升VD大鼠異常降低的血清Livin含量，緩解海馬神經(jīng)元細胞損傷。

穴位埋線療法屬于針灸療法的一個分支，是經(jīng)絡理論與現(xiàn)代醫(yī)學手段相結(jié)合的產(chǎn)物，是在中醫(yī)理論指導下，采用不同型號的羊腸線，根據(jù)需要有選擇地埋入穴位，通過羊腸線對穴位的持續(xù)刺激作用，達到治療疾病的一種外治方法，已經(jīng)廣泛應用于臨床各科[9]。由于VD是一種需要長期治療的疾病，目前針刺療效肯定，而穴位埋線每20～30 d治療1次，故避免需較長時間每日針刺的痛苦，使家屬及患者更能堅持長期的治療，所以穴位埋線不失為一種較為切實的治療方法。中醫(yī)認為，癡呆病人多屬本虛標實，氣虛血瘀。氣虛則神失所養(yǎng)，瘀血則可隨經(jīng)脈流行入腦，與精髓錯雜，致使清竅受蒙，靈機呆鈍而出現(xiàn)神識不清，表情癡呆諸癥。筆者選取百會、膈俞、氣海、三陰交（雙）、膻中組成益氣活血方。百會為諸陽、百脈之會，可開竅醒神、回陽固脫。膈俞有開胸通膈治療氣滯血瘀之功。氣海培補元氣。三陰交可健脾益氣，調(diào)補肝腎。膻中為氣會，有理肺氣、通乳絡之功。以上五穴共同組合，共奏益氣活血之功。本實驗以此為基礎，運用穴位埋線治療實驗性VD大鼠，觀察大鼠血清Livin含量變化與埋線治療的療效關(guān)系，為臨床運用穴位埋線治療VD提供一定的理論依據(jù)。

Morris水迷宮已經(jīng)廣泛地用于動物空間學習記憶研究的實驗。空間學習記憶是檢測動物空間方向、反射時間、視知覺和結(jié)構(gòu)應用等能力，從而評價其認知水平的一種行為模式，是一類關(guān)于場景和事件的學習記憶，因能較好地檢測到實驗動物的空間學習記憶功能，并有排除動物在完成作業(yè)而經(jīng)過的途中所留下的排泄物和所分泌的外激素對其它動物作業(yè)成績產(chǎn)生影響等優(yōu)點，因而在國內(nèi)外被廣泛采用[10]。本實驗采用經(jīng)典的4-VO建立VD模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠找到站臺的時間比對照組大鼠明顯延長；第7天撤去站臺后，VD模型組大鼠第Ⅲ象限游泳時間和穿越站臺次數(shù)比對照組明顯減少，結(jié)果表明，模型組大鼠學習記憶能力較對照組明顯減退，應用4-VO改良法成功復制了VD模型大鼠。采用穴位埋線治療后，大鼠找到站臺的時間較VD模型組明顯縮短，學習記憶成績接近對照組，提示穴位埋線能有效改善VD大鼠的學習記憶能力。

結(jié)果顯示，VD模型組血清Livin顯著低于假手術(shù)組，穴位埋線組與VD模型組相比，具有顯著性差異（P<0.01），與尼莫地平組相比，無顯著性差異（P>0.05）。病理結(jié)果顯示，VD模型組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元嚴重受損，導致學習記憶能力降低，穴位埋線組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元恢復良好，無嚴重變性和壞死，說明穴位埋線可緩解腦缺血性損傷的神經(jīng)細胞凋亡，從而改善學習記憶。本研究結(jié)果表明，提升血清Livin含量，緩解腦缺血后細胞凋亡，減輕海馬神經(jīng)元的損傷，可能是穴位埋線改善癡呆癥狀的機理之一。

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