,

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,湖南長沙 410128)

響應(yīng)面法優(yōu)化魯氏接合酵母產(chǎn)MAP酶條件

謝夢(mèng)琴,王遠(yuǎn)亮*

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,湖南長沙 410128)

為研究產(chǎn)MAP酶的最佳培養(yǎng)條件,以魯氏接合酵母為原料,MAP酶為響應(yīng)值,在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上根據(jù)Box-behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,采用三因素三水平的響應(yīng)面分析法對(duì)MAP酶培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化,通過響應(yīng)面實(shí)驗(yàn),建立了MAP酶含量與三個(gè)因素變化的二次回歸方程。同時(shí)根據(jù)回歸模型進(jìn)行了計(jì)算機(jī)模擬實(shí)驗(yàn)并繪制了曲面圖,探索MAP酶隨主要因素水平的變化規(guī)律與優(yōu)化點(diǎn)。結(jié)果表明,魯氏接合酵母產(chǎn)MAP酶最佳培養(yǎng)條件為:溫度27℃、鹽濃度9.28%、培養(yǎng)時(shí)間80.4h,此培養(yǎng)條件下MAP酶濃度3.189ng/mL。

MAP酶,魯氏接合酵母,響應(yīng)面分析

促有絲分裂原蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAP酶)屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,存在于酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中[1]。MAPK鏈?zhǔn)怯蒑APKKK、MAPKK和MAPK三類蛋白激酶組成,是酵母菌和動(dòng)物體內(nèi)一種重要的信號(hào)傳遞途徑[2-3]。生物在受到諸如機(jī)械壓力、創(chuàng)傷、鹽害(滲透壓改變)、極端溫度等不同的創(chuàng)傷時(shí),均能誘導(dǎo)和激活MAPK鏈,將不同的細(xì)胞膜感受器與細(xì)胞應(yīng)答聯(lián)系起來,響應(yīng)各種生物以及非生物脅迫[4]。在現(xiàn)代醬油的釀造很多都是采用高鹽稀態(tài)的發(fā)酵方法,在高鹽的環(huán)境下,大多微生物都死亡,而耐鹽魯氏接合酵母在醬油后酵過程中產(chǎn)生醇和酯類等與醬油風(fēng)味及其相關(guān)的物質(zhì),對(duì)醬油獨(dú)特風(fēng)味的形成有十分重要的貢獻(xiàn)[5-7]。優(yōu)化魯式接合酵母產(chǎn)MAP酶條件,對(duì)魯式氏接合酵母應(yīng)對(duì)這種高鹽環(huán)境很有理論意義。

響應(yīng)面分析法(response surface methodology)系采用多元二次回歸方法作為函數(shù)估計(jì)的工具,包括實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、建立模型、分析模型合理性和尋求最優(yōu)解等眾多實(shí)驗(yàn)與統(tǒng)計(jì)技術(shù)[8]。響應(yīng)面分析法可以減少實(shí)驗(yàn)次數(shù)、優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件、提高生產(chǎn)效率、解決生產(chǎn)實(shí)際問題。該法在生物培養(yǎng)方面已有廣泛應(yīng)用,韓學(xué)易[9]等利用響應(yīng)面法優(yōu)化巨大芽孢桿菌產(chǎn)纖維素酶發(fā)酵條件后,纖維素酶活力為2.152U/mL,提高了50%。張大皓[10]等利用響應(yīng)面優(yōu)化脂肪酶發(fā)酵條件,酶活比之前提高了43%。因此,本實(shí)驗(yàn)采用單因素實(shí)驗(yàn)和Design-Expert軟件中的Box-Benhnken設(shè)計(jì)法、響應(yīng)面分析方法對(duì)魯氏接合酵母產(chǎn)MAP酶條件優(yōu)化,為魯氏接合酵母更好適應(yīng)醬油后期發(fā)酵提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

魯氏接合酵母 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供；葡萄糖 北京鼎國有限公司；氯化鈉 北京鼎國有限公司；MAP2 ELISA試劑盒 購自SIGMA公司；蝸牛酶 北京鼎國有限公司；PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯汁200g、葡萄糖20g、水1000mL；不同NaCl濃度PDA培養(yǎng)基:分別取2、4、6、8、10、12gNaCl到50mL容量瓶中,用PDA培養(yǎng)基定容至50mL,配制成鹽濃度分別為4%、8%、12%、16%、20%、24%的PDA培養(yǎng)基,備用。

SKY-2102C搖床培養(yǎng)箱 國力天(深圳)科技有限公司；TGL-20M冷凍離心機(jī) 長沙英泰儀器有限公司；U410-86-80℃冰箱 New Brunswick Scientific Coopration；HH-8數(shù)顯恒溫水浴鍋 上海浦東物理光學(xué)儀器廠；WellWash4 MK2洗板機(jī) 賽默飛世爾科技(中國)有限公司；MB100-2A恒溫振蕩器 賽默飛世爾科技(中國)有限公司；3001酶標(biāo)儀 賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)方法 魯氏結(jié)合酵母在PDA斜面培養(yǎng)基上30℃培養(yǎng)24～36h,用無菌的生理鹽水將其制備成濃度為1×107CFU/mL的菌懸液。100mL三角瓶中裝入PDA培養(yǎng)基20mL,按3%接種量接入魯氏接合酵母菌懸液,轉(zhuǎn)速120r/min,28℃搖床培養(yǎng)48h。

1.2.2 魯氏結(jié)合酵母蛋白的提取 取10mL菌懸液,離心,收集菌體,加入2mL 100mg/L濃度的蝸牛酶將菌沉淀懸起后常溫下孵育20min,-80℃冰箱放置10min后,迅速移至37℃水浴箱10min,反復(fù)5次左右,離心收集上清液。

1.2.3 MAP酶測(cè)定方法 分別在酶標(biāo)板上設(shè)置微管相關(guān)蛋白標(biāo)準(zhǔn)品孔12個(gè),每兩個(gè)孔為一個(gè)編號(hào),樣品孔1個(gè)、空白孔1個(gè),分別在不同編號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)品孔中分別加入0.6、0.4、0.2、0.1、0.05ng/mL的微管相關(guān)蛋白標(biāo)準(zhǔn)品、樣品孔中加入樣品稀釋液40μL和待測(cè)樣品10μL,空白孔加入50μL樣品稀釋液,37℃溫育30min后,用洗滌液清洗5次,拍干,再往酶標(biāo)板孔中加入酶標(biāo)試劑50μL(空白孔除外),37℃溫育30min后,洗滌,加入50μL顯色劑A和顯色劑B,混勻,37℃避光顯色15min后,加入終止液50μL,450nm波長依序測(cè)量各孔的吸光度(OD值),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并算出各樣品濃度。

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1 溫度對(duì)MAP酶含量的影響 取PDA培養(yǎng)基5份,在0.3%的接種量,自然pH,鹽濃度為8%,轉(zhuǎn)速為120r/min的條件下培養(yǎng),培養(yǎng)的溫度分別為20、24、28、32、36℃,培養(yǎng)3d,用MAP酶聯(lián)免疫方法測(cè)其濃度。

1.2.4.2 時(shí)間對(duì)MAP酶含量的影響 取PDA培養(yǎng)基5份,在0.3%的接種量,自然pH,鹽濃度為8%,溫度28℃、轉(zhuǎn)速為120r/min的條件下培養(yǎng),培養(yǎng)時(shí)間分別為2、3、4、5、6d,用MAP酶聯(lián)免疫方法測(cè)其濃度。

1.2.4.3 鹽濃度對(duì)MAP酶含量的影響 取PDA培養(yǎng)基5份,在0.3%的接種量,自然pH,轉(zhuǎn)速為120r/min的條件下培養(yǎng),培養(yǎng)的鹽濃度分別為0、4%、8%、12%、16%,20%、24%,培養(yǎng)3d,用MAP酶聯(lián)免疫方法測(cè)其濃度。

1.2.5 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 采用Design-Expert 8.0.6軟件中的Box-behnken(BBD)中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。根據(jù)單因素影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選取培養(yǎng)時(shí)間、溫度及鹽濃度3個(gè)因素作為實(shí)驗(yàn)因素,以MAP酶含量作為響應(yīng)值,采用三因素三水平的響應(yīng)面分析方法設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)因素及水平見表1。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平Table 1 Factors and levels of the response surface method

2 結(jié)果與分析

2.1 MAP酶標(biāo)準(zhǔn)曲線

以MAP酶濃度為橫坐標(biāo),OD值為縱坐標(biāo),其線性回歸方程為:y=5.4928x-0.2422,R2=0.9959。說明曲線可信度較高,可以應(yīng)用。

圖1 MAP酶標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Calibration curve of MAPase

2.2單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 培養(yǎng)溫度對(duì)MAP酶濃度的影響 從圖2可以看出,培養(yǎng)溫度對(duì)MAP酶濃度影響較大,當(dāng)溫度為20～28℃時(shí),隨溫度增加MAP酶濃度明顯增加,在28℃時(shí)達(dá)到最高,溫度28～36℃時(shí)MAP酶濃度明顯下降。原因是高溫影響了魯氏接合酵母的生長,影響了MAP酶的產(chǎn)生,因此選擇溫度28℃為宜。

圖2 溫度對(duì)MAP酶濃度的影響Fig.2 Effect of temperature on MAPase concentration

2.2.2 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)MAP酶濃度的影響 從圖3可以看出,培養(yǎng)時(shí)間對(duì)MAP酶濃度影響顯著。在8%鹽濃度條件下,培養(yǎng)前期的1～3d內(nèi),MAP酶濃度隨培養(yǎng)時(shí)間的延長而逐漸上升；但隨著時(shí)間的進(jìn)一步延長,MAP酶在發(fā)酵液中的濃度有所下降。因?yàn)榇藭r(shí)魯氏接合酵母已經(jīng)進(jìn)入生長周期的穩(wěn)定期,MAP的產(chǎn)量主要受酵母菌活菌影響,故選擇培養(yǎng)時(shí)間3d為宜。

圖3 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)MAP酶濃度的影響Fig.3 Effect of time on MAPase concentration

2.2.3 鹽濃度對(duì)MAP酶濃度的影響 由圖4可知,鹽濃度對(duì)MAP酶濃度影響十分明顯。料液比在0%～8%之間時(shí),MAP酶濃度隨鹽度的增加而上升,在這樣的鹽濃度內(nèi),可能是由于鹽脅迫激活了MAP酶鏈,產(chǎn)生MAP酶響應(yīng)這種高鹽脅迫,從而產(chǎn)生大量的MAP酶。而隨著鹽濃度進(jìn)一步增加,MAP酶含量明顯下降,是因?yàn)榇藭r(shí)鹽的濃度已經(jīng)影響了魯氏接合酵母菌的生長,因此選擇鹽濃度為8%。

圖4 鹽濃度對(duì)MAP酶濃度的影響Fig.4 Effect of salt on MAPase concentration

2.3響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.3.1 回歸模型的建立及其分析 利用Design-Expert7.1.6統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)式回歸分析,建立魯氏接合酵母產(chǎn)MAP酶的最適培養(yǎng)條件的回歸模型,得到MAP酶活對(duì)編碼自變量A、B及C的二次多項(xiàng)回歸方程。

通過多元回歸擬合分析得到以MAP酶濃度為目標(biāo)函數(shù)與各因變量溫度,時(shí)間,鹽濃度的二次回歸方程模型:

MAP酶濃度=3.11+0.073A+0.19B+0.19C-0.39AB-0.34AC-0.29BC-0.34A2-0.27B2-0.28 C2

對(duì)該模型進(jìn)行方差分析及模型系數(shù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn),結(jié)果見表3。p<0.05表示該項(xiàng)指標(biāo)顯著,由表3可知,回歸模型極其顯著(p<0.0001),說明建立的模型有意義；失擬項(xiàng)p=0.0503>0.05,無顯著性差異,說明模型擬合度良好,可用此模型和方程來分析和預(yù)測(cè)。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Experimental design and results of the response surface method

由表4可知,Y的變異系數(shù)CV表示實(shí)驗(yàn)的精確度,CV值越高,實(shí)驗(yàn)的可靠性越低,本實(shí)驗(yàn)中CV=1.96,較低,說明實(shí)驗(yàn)操作可信。

表3 響應(yīng)面方差分析結(jié)果Table 3 Result of response surface quadratic model

注:**,p<0.01,差異極顯著。

表4 模型的可信度分析Table 4 Analysis for determination of model

2.3.2 響應(yīng)曲面分析與優(yōu)化 響應(yīng)面圖是利用軟件根據(jù)回歸方程繪制的,是響應(yīng)值在各實(shí)驗(yàn)因素交互作用下得到的結(jié)果構(gòu)成的一個(gè)三維空間曲面,可以預(yù)測(cè)和檢驗(yàn)變量的響應(yīng)值以及確定變量的相互關(guān)系。分析當(dāng)溫度、時(shí)間和鹽濃度其中有1個(gè)因素固定時(shí),另外2個(gè)因素及其交互作用對(duì)MAP酶濃度的影響。根據(jù)回歸方程做出模型的響應(yīng)曲面見圖5～圖7。

圖5 培養(yǎng)溫度與時(shí)間對(duì)MAP酶濃度影響的曲面圖Fig.5 The response surface polt for the effects of the temperature and time on MAPase concentration

圖6 鹽濃度與溫度對(duì)MAP酶濃度影響的曲面圖Fig.6 The response surface polt for the effects of the salt and temperature on MAPase concentration

圖7 鹽濃度與時(shí)間對(duì)MAP酶濃度影響的曲面圖Fig.7 The response surface polt for the effects of the salt and time on MAPase concentration

響應(yīng)面圖形是響應(yīng)值對(duì)各實(shí)驗(yàn)因子X1,X2,X3所構(gòu)成的三維空間的曲面圖,從響應(yīng)面分析圖上可形象地看出最佳參數(shù)及各參數(shù)之間的相互作用。響應(yīng)面圖有頂峰,證實(shí)影響因素的最佳值落在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的取值范圍內(nèi)。由響應(yīng)面圖可以看出,在鹽濃度一定時(shí),隨著時(shí)間與溫度增加,魯氏接合酵母中MAP酶濃度先增加后減??；在時(shí)間一定時(shí),隨著鹽濃度與溫度增加,魯氏接合酵母中MAP酶濃度先增加后減小；在溫度一定時(shí),隨著鹽濃度與時(shí)間的增加,魯氏接合酵母中MAP酶先增加后減小。利用Design-Expert7.1.6進(jìn)行優(yōu)化處理得到魯氏接合酵母產(chǎn)MAP酶最優(yōu)的培養(yǎng)條件為:溫度27℃、鹽濃度9.28%,培養(yǎng)時(shí)間80.4h,此條件下魯氏結(jié)合酵母產(chǎn)MAP酶濃度為3.166ng/mL。

2.3.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)與響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果,得到魯氏接合酵母產(chǎn)MAP酶的最優(yōu)培養(yǎng)條件為溫度27℃、鹽濃度9.28%、培養(yǎng)時(shí)間80.4h,做5組驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),得其MAP酶濃度為3.189±0.177ng/mL,預(yù)測(cè)值與實(shí)驗(yàn)值之間具有良好的擬合性,表明模型有效、可靠。

3 結(jié)論

本研究是在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上,利用響應(yīng)面法優(yōu)化魯氏接合酵母產(chǎn)MAP酶條件,通過對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析可知,本實(shí)驗(yàn)中對(duì)MAP酶濃度的影響程度大小依次為鹽濃度>時(shí)間>溫度。研究結(jié)果表明魯氏接合酵母產(chǎn)MAP酶最佳培養(yǎng)條件為溫度27℃、鹽濃度9.2%,培養(yǎng)時(shí)間80h,此培養(yǎng)條件下魯氏接合酵母MAP酶的濃度為3.189ng/mL。

[1]Tena G,Asai T,Chiu WL,etal. Plant Mitogen-activated protein kinase signaling cascades[J]. Currentopinion.Plant Biology,2001,74:392-400.

[2]Davis R. Signal transduction by the JNK group of MAP kinase[J]. Cell,2000,103:239-252.

[3]Madhani HD,Fink G R. The riddle of MAP kinase signaling specificity[J]. Trends Genet,1998,14:151-155.

[4]Jonak C.Complexity,cross talk and integration of plant MAP kinase signaling[J]. Current Opinion Plant Biology,2002,5:415-424.

[5]Murooka Y,Yamshita M. Traditional healthful fermented products of Japan[J]. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology,2008(35):791-798.

[6]Kataoka S.Functional effects of Japanese style fermented soy sauce(Shoyu)and its components[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering,2005(100):227-234.

[7]Ohata M,Kohama K,Morimitsu Y,etal. The formation mechanism by yeast of the2(or5)-ethy5(or2)-methyl-4-hydroxy-3(2H)-furanone in Miso[J]. Biosci Biotech Biochem,2007,71:407-413.

[8]Majumder A,Bhandari S,Purama RK,etal. Enhanced production of a novel dextran from Leuconostocmesenteroides NRRL B-640 by response surface methodology[J]. Ann Microbiol,2009,59(2):309-315.

[9]韓學(xué)易,唐自鐘,胡玉龍,等.響應(yīng)面優(yōu)化巨大芽孢桿菌產(chǎn)纖維素酶發(fā)酵條件[J].四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2013,31(3):319-321.

[10]張大皓,譚天偉.響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化脂肪酶發(fā)酵培養(yǎng)基[J].北京化工大學(xué)學(xué)報(bào),2006,33(2):41-44.

Optimization of MAPASE producing fromZygosaccharomycesrouxiiby response surface method

XIEMeng-qin,WANGYuan-liang*

(College of Food Science and Technology,Hunan Agricultural University,Changsha 410128,China)

Using MAPase concentration as the response value,Zygosaccharomycesrouxiias the raw material to study the optimal MAPK conditions. Based on the result of single-factor test,response surface methodology with 3 factors and 3 levels was adopted according to box-behnken experiment design principle. Two regression equations for the influence relationship of MAPase concentration and three varietals factors were established. On the basis of regression models,the results with surface were simulated to give optimized result and trends of the main factors on the educing sugar concentration. The optimal MAPK conditions were as follows:the temperature was 27℃,salt Concentration 9.28%,time 80.4 hours. Under this condition the MAPase concentration was 3.189ng/mL.

MAPase;Zygosaccharomycesrouxii; response surface method

2014-03-05 *通訊聯(lián)系人

謝夢(mèng)琴(1989-)，女，碩士，研究方向：食品生物技術(shù)。

國家自然基金項(xiàng)目(31000809)。

TS264.2

A

1002-0306(2014)17-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2014.17.001