, ,, ,,

(1.安徽工程大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院,安徽蕪湖 241000；2.皖南醫(yī)學(xué)院微生物與免疫學(xué)教研室,安徽蕪湖 241000)

BacilluscereusSG0310L發(fā)酵罐中產(chǎn)胞外膽固醇氧化酶發(fā)酵條件優(yōu)化

葛飛1,龔倩1,張慧敏1,黃寅1,石貝杰1,桂琳2,*

(1.安徽工程大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院,安徽蕪湖 241000；2.皖南醫(yī)學(xué)院微生物與免疫學(xué)教研室,安徽蕪湖 241000)

目的:優(yōu)化菌株BacilluscereusSG03在10L發(fā)酵罐中產(chǎn)膽固醇氧化酶的工藝條件,為該菌株的進(jìn)一步應(yīng)用提供依據(jù)。方法:在10L發(fā)酵罐中,通過單因素實(shí)驗(yàn),分別考察了培養(yǎng)液起始pH、攪拌速率、溶解氧(DO)濃度對(duì)BacilluscereusSG03產(chǎn)胞外膽固醇氧化酶的影響。結(jié)果:較佳的發(fā)酵條件為培養(yǎng)液起始pH6.8、攪拌速率250r/min、溶解氧(DO)濃度80%。在此基礎(chǔ)上,對(duì)發(fā)酵過程進(jìn)行了兩階段DO控制,發(fā)酵前20h DO控制在90%,然后調(diào)整為20%,直至發(fā)酵結(jié)束。較單一DO控制,最大胞外膽固醇氧化酶產(chǎn)量、生產(chǎn)效率分別提高了30.2%和20.0%,達(dá)到了1.38U/mL和0.03U/(mL·h)。

蠟狀芽孢桿菌,膽固醇氧化酶,發(fā)酵罐,兩段溶解氧控制

膽固醇氧化酶(COD)是一種雙功能的黃素酶,能夠催化膽固醇氧化為膽甾-4-烯-3-酮,在許多細(xì)菌中都發(fā)現(xiàn)具有此酶[1-2]。膽固醇氧化酶在醫(yī)學(xué)[3]、農(nóng)業(yè)[4]和生物催化[5]方面有著廣泛的應(yīng)用。

國內(nèi)外學(xué)者對(duì)微生物來源的膽固醇氧化酶的特性、結(jié)構(gòu)、應(yīng)用和基因克隆等方面進(jìn)行了大量研究,并取得了不少成果[6]。桑吉等采用超聲波聯(lián)合亞硝基胍的復(fù)合誘變方法處理膽固醇氧化酶產(chǎn)生菌(甾短桿菌),使其產(chǎn)酶能力提高了140%,酶活達(dá)到了1.21U/mL[7]。許曉燕等對(duì)Brevibacteriumsp. 產(chǎn)膽固醇氧化酶的發(fā)酵條件及其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究,在最適條件下,膽固醇氧化酶的酶活力達(dá)到24.01U/mg[8]。王瓊等對(duì)一株紅球菌屬膽固醇氧化酶高產(chǎn)菌株的分子生物學(xué)鑒定及酶學(xué)特性的研究[9]。Sun Y等研究表明,通過對(duì)COD活性中心保守序列區(qū)域內(nèi)的氨基酸殘基進(jìn)行定點(diǎn)突變,可有效提高突變酶的熱穩(wěn)定性[10]。

本文在搖瓶實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)上,獲取最佳培養(yǎng)基配方和乳化劑后,進(jìn)一步考察了培養(yǎng)液初始pH、攪拌速率和DO對(duì)BacilluscereusSG03在10L發(fā)酵罐中產(chǎn)胞外COD的影響,為該菌株進(jìn)一步擴(kuò)大生產(chǎn)COD提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1 菌種BacilluscereusSG03由安徽工程大學(xué)生物工程教研室篩選、保藏。

1.1.2 主要試劑 蒽酮,膽固醇,4-安基-安替比林,TritonX-100購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；辣根過氧化物酶購自美國Sigma公司。

1.1.3 培養(yǎng)基(g/L) 斜面培養(yǎng)基:牛肉膏 5,蛋白胨 10,NaCl 5,瓊脂 20,pH自然；

種子培養(yǎng)基:葡萄糖 20,牛肉膏 5,蛋白胨 10,NaCl 5,pH自然；

發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖 2,膽固醇2,蛋白胨 4,K2HPO40.2,MgSO4·7H2O 0.05,FeSO4·7H2O 0.01,CH3COONH42,NaCl 1,吐溫80 3,CaCl20.1,pH自然。

1.1.4 主要儀器設(shè)備 BIOTECH-10JSA 3L-10L發(fā)酵罐 上海保興生物設(shè)備工程有限公司；QHZ-123B組合式全溫度振蕩培養(yǎng)箱 江蘇省太倉市華美生化儀器廠；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市杰瑞爾電器有限公司；L5型紫外可見分光光度計(jì) 上海儀電分析儀器有限公司;L550型臺(tái)式低速離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；TG16-W微量高速離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；KQ-250DE型醫(yī)用數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 10L發(fā)酵罐培養(yǎng)條件 10L發(fā)酵罐按6.5L裝液量將發(fā)酵培養(yǎng)基加入發(fā)酵罐,121℃滅菌30min,冷卻至30℃,將活化好的搖瓶種子液按3%的接種量接入發(fā)酵罐,培養(yǎng)溫度33℃,通氣量1∶1～1∶1.3,攪拌轉(zhuǎn)速200～350r/min,起始pH自然,培養(yǎng)時(shí)間56h。在此基礎(chǔ)上,考察起始pH、攪拌速率、DO等因素對(duì)SG03菌株發(fā)酵過程的影響。

1.2.2 膽固醇氧化酶活力的測定 按照參考文獻(xiàn)[11]進(jìn)行COD酶活測定。酶活力顯色體系:4-氨基-安替比林1.4mmol/L,苯酚7mmol/L,磷酸鉀緩沖液50mmol/L(pH=7.0),辣根過氧化物酶6U/mL,膽固醇lmmol/L,Triton X-100 l%。

酶活定義:每分鐘催化生成1mmol H2O2所需酶量為一個(gè)活力單位。標(biāo)準(zhǔn)曲線確定:取酶活力顯色體系3mL于試管中,37℃保溫3min,分別加入濃度為2.5mmol/L的H2O2溶液50、100、150、200、250μL,反應(yīng)5min后測OD500值。

酶活測定:取顯色體系溶液3mL于試管中,37℃保溫3min,加入0.1mL酶液,37℃準(zhǔn)確反應(yīng)10min,沸水浴加熱3min終止反應(yīng),冷卻后測OD500。

酶活計(jì)算公式:酶活=0.1996×X×V×K/T,式中:X為反應(yīng)液的吸光度A500；V為反應(yīng)液總體積(mL)；K為酶液稀釋倍數(shù)；T為反應(yīng)時(shí)間(min)。

1.2.3 DO值控制 發(fā)酵液 DO通過溶氧電極來檢測(以一定條件下溶解氧量相對(duì)于飽和溶解氧量的百分比來表示)。

1.2.4 生物量的測定 用真空泵和抽濾瓶對(duì)一定量的發(fā)酵醪進(jìn)行抽濾,用蒸餾水反復(fù)沖洗3次菌體后,收集濕菌體置于55℃電熱鼓風(fēng)干燥箱中烘干至恒重后,準(zhǔn)確稱重,得菌絲干重(生物量)。

生物量(g/L)=菌絲體重量(g)/發(fā)酵液體積(L)

1.2.5 發(fā)酵過程中相關(guān)參數(shù)的計(jì)算

菌體平均生長速率=(最大生物量-接種量)/(接種量×獲得最大生物量的培養(yǎng)時(shí)間)；

COD生產(chǎn)率=凈最大COD產(chǎn)量/獲得最大COD產(chǎn)量的培養(yǎng)時(shí)間。

1.2.6 估算菌體比生長速率(μ)和產(chǎn)物比生產(chǎn)速率(ρ) 估算μ和ρ,參照文獻(xiàn)[12-13]。根據(jù)μ和ρ的定義:

式(1)

當(dāng)時(shí)間間隔很小時(shí),可以近似用式(2)估算得到μ和ρ:

式(2)

式(1)和(2)中,μ:比生長速率；ρ:產(chǎn)物比生產(chǎn)速率；X:生物量；P:COD產(chǎn)量。

因此,根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以用式(2)直接估算得到不同培養(yǎng)時(shí)刻的μ和ρ。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理方法 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值。采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1BacilluscereusSG03在10L發(fā)酵罐中生物量、胞外COD酶活變化情況

在1.2.1的發(fā)酵條件下,SG03生物量和胞外COD酶活變化如圖1所示。

圖1 SG03 10L發(fā)酵罐中生物量和酶活變化曲線Fig.1 The curve of biomass and enzyme activity of COD in the broth of SG03 in a 10L fermentor

由圖1可以看出,生物量、胞外COD酶活均呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢,生物量在發(fā)酵第36h出現(xiàn)最大值,為14.08g/L；COD酶活在發(fā)酵第40h出現(xiàn)最大值,為1.14U/mL。酶活最大值的出現(xiàn)比生物量最大值滯后4h。在發(fā)酵第12h后,生物量增加趨勢變大,這一時(shí)期持續(xù)到第36h左右,此后生物量開始下降,第48h后下降趨勢進(jìn)一步加大。

在發(fā)酵前16h,COD酶活增加比較緩慢,16h以后產(chǎn)酶水平增加比較明顯,在發(fā)酵第40h時(shí),酶活出現(xiàn)最大值,隨后呈降低趨勢。在發(fā)酵第56h,胞外COD酶活僅為0.99U/mL,比最高酶活降低了13.2%。

2.2培養(yǎng)液起始pH對(duì)SG03產(chǎn)胞外COD的影響

pH是微生物發(fā)酵過程中重要參數(shù)之一,它對(duì)細(xì)胞生長和代謝產(chǎn)物的合成有重要影響。搖瓶實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,培養(yǎng)液起始pH為6.5～7.0范圍內(nèi)時(shí)較有利于胞外COD的合成。為了進(jìn)一步了解pH對(duì)10L發(fā)酵罐中SG03產(chǎn)胞外COD的影響,本文考察了在10L發(fā)酵罐中培養(yǎng)液起始pH分別為5.8、6.3、6.8、7.5和8.0時(shí)對(duì)胞外COD合成的影響,結(jié)果如圖2所示。

圖2 pH對(duì)產(chǎn)膽固醇氧化酶的影響Fig.2 The effect of pH on enzyme activity of COD in the broth

由圖2可見,除起始pH為8.0時(shí)胞外COD酶活最大值出現(xiàn)在發(fā)酵的第36h外,其他條件下均出現(xiàn)在第40h。初始pH為5.8、6.3、6.8、7.5和8.0時(shí),發(fā)酵過程中COD最高酶活分別為1.03、1.09、1.14、0.93和0.48U/mL,說明SG03菌株于10L發(fā)酵罐中在中性偏酸的環(huán)境下更有利于發(fā)酵液中COD的積累,因此,培養(yǎng)液的較佳初始pH確定為6.8。

2.3攪拌速率對(duì)COD產(chǎn)生的影響

發(fā)酵罐培養(yǎng)過程中,過低的攪拌速率會(huì)使DO降低,不利于菌體的生長和代謝產(chǎn)物的合成；過高的攪拌速率又會(huì)造成發(fā)酵液產(chǎn)生大量氣泡,導(dǎo)致發(fā)酵液逃逸,影響菌體生長代謝,甚至引起染菌。為了確定較佳的攪拌速率,本文考察了攪拌速率分別為200、250、300和350r/min時(shí),對(duì)胞外COD合成的影響,結(jié)果如圖3所示。

圖3 攪拌速率對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.3 The effect of stirring rate on enzyme activity of COD in the broth

由圖3可見,當(dāng)攪拌速率分別為200、250、300和350r/min時(shí),胞外COD酶活的最大值分別出現(xiàn)在發(fā)酵的第40、40、40和36h,且酶活分別為1.13、1.19、1.18和1.09U/mL。較高的攪拌速率下,胞外COD的最大值反而較小,原因可能是由于轉(zhuǎn)速過高產(chǎn)生了大量泡沫,造成發(fā)酵液逃逸,使培養(yǎng)液中COD誘導(dǎo)物膽固醇大量聚集,不能很好的分散到發(fā)酵液中,進(jìn)而影響胞外COD的合成。因此,確定較佳攪拌速率為250r/min。

2.4 DO對(duì)COD產(chǎn)生的影響

對(duì)于好氧微生物來說,發(fā)酵液中DO濃度對(duì)微生物生長和產(chǎn)物形成有著重要影響。本文考察了不同DO濃度對(duì)SG03產(chǎn)胞外COD的影響,實(shí)驗(yàn)通過改變通氣速率控制培養(yǎng)液的DO,實(shí)驗(yàn)選取DO控制在20%、40%、60%、80%和90%五個(gè)不同水平。

不同DO濃度對(duì)SG03產(chǎn)胞外COD的影響如圖4所示。當(dāng)DO分別控制在20%、40%、60%、80%和90%的空氣飽和度時(shí),最高酶活分別為0.91、0.93、0.96、1.06和1.04U/mL。隨著DO濃度的增加,胞外COD酶活最大值出現(xiàn)的時(shí)間逐漸提前,分別為發(fā)酵的第52、52、48、40和36h。當(dāng)DO為90%時(shí),COD酶活在第36h已達(dá)最大值,比DO濃度控制在20%和40%時(shí),胞外COD酶活最大值出現(xiàn)的時(shí)間整整提前了16h；但隨后酶活開始下降,原因可能是過高的DO導(dǎo)致菌體死亡速度加劇和酶活快速衰減。由以上DO實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出,在SG03發(fā)酵過程中,發(fā)酵前期較高的DO濃度較有利于胞外COD的積累,發(fā)酵后期較低的DO濃度較有利于胞外COD的積累；同時(shí),DO對(duì)SG03產(chǎn)胞外COD的影響較培養(yǎng)液起始pH、攪拌速率等因素的影響要大,因此,為了獲得更高的COD產(chǎn)量,提出在發(fā)酵過程中實(shí)施兩階段DO控制策略。

圖4 DO對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.4 The effect of DO on enzyme activity of COD in the broth

2.5兩階段DO控制對(duì)COD產(chǎn)生的影響

由表1可知,在單一DO控制實(shí)驗(yàn)中,隨著DO從90%降到20%,菌體最大生物量和細(xì)胞平均生長速率相應(yīng)下降,這表明在DO 20%時(shí),部分細(xì)胞呼吸代謝受到了限制。但是,與DO90%相比,DO為80%時(shí),COD產(chǎn)量最高。這表明在產(chǎn)物合成期,并非溶解氧越大越有利于COD合成。因此,我們推斷COD的產(chǎn)生可能與菌體生長對(duì)氧的要求不一樣。另外,我們從圖4還可以看出,雖然當(dāng)DO控制在較低濃度20%和40%時(shí),COD的最大產(chǎn)量均低于最高的DO80%。但在發(fā)酵的第40h后,仍然有較強(qiáng)的COD合成能力,COD酶活增加趨勢一直維持到發(fā)酵的第52h,即菌體在發(fā)酵后期具有較大的COD比生產(chǎn)速率(ρ值)；此時(shí),較高溶解氧濃度80%和90%條件下的COD比生產(chǎn)速率已呈明顯下降趨勢。

表1 DO對(duì)SG03產(chǎn)生COD的影響Table1 Effects of various DO control on the COD production in submerged fermentation of SG03 in 10L bioreactor

注:最大生物量和最大COD產(chǎn)量一欄中括號(hào)中的時(shí)間表示該數(shù)值出現(xiàn)的時(shí)間。

由圖4可以看出,在單一DO控制實(shí)驗(yàn)中,培養(yǎng)前期,DO濃度控制在90%時(shí),COD比生產(chǎn)速率ρ值高于其它DO濃度；培養(yǎng)后期,DO控制在20%時(shí),ρ值高于其它DO濃度。因此,為了在整個(gè)發(fā)酵過程中都能獲得較高的ρ值,提出兩階段DO控制策略:發(fā)酵前期(前20h)DO控制在90%,當(dāng)ρ值下降時(shí),DO控制轉(zhuǎn)至20%,直到發(fā)酵結(jié)束。

圖5顯示了在10L發(fā)酵罐中實(shí)施兩階段DO控制策略時(shí),SG03發(fā)酵動(dòng)態(tài)變化過程。發(fā)酵前期,ρ值在培養(yǎng)的第20h達(dá)到一個(gè)較大值,隨后ρ值開始出現(xiàn)下降,此時(shí)將DO從90%變?yōu)?0%。通過實(shí)施兩階段DO控制策略,胞外COD產(chǎn)量最大值和生產(chǎn)率分別達(dá)到了1.38U/mL和0.03U/(mL·h),較單階段DO控制時(shí)獲得的最高胞外COD產(chǎn)量和生產(chǎn)率分別增加了30.2%和20.0%。

圖5 10L發(fā)酵罐中兩階段DO控制時(shí) SG03發(fā)酵動(dòng)態(tài)變化過程Fig. 5 Time profiles of cell growth,ρ and COD production in submerged fermentation of SG03 with two-stage DO control in 10L fermentor

3 結(jié)論

目前,COD在美國、日本等發(fā)達(dá)國家已經(jīng)進(jìn)入商品化生產(chǎn),主要以發(fā)酵法進(jìn)行生產(chǎn)。該酶及其氧化產(chǎn)物在臨床診斷、制藥、食品和農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用,商業(yè)價(jià)值巨大。我們國家對(duì)COD的使用主要依賴于進(jìn)口,因此加強(qiáng)對(duì)COD的理論和應(yīng)用研究,具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

本文在10L發(fā)酵罐中,研究了不同發(fā)酵條件對(duì)BacilluscereusSG03菌株產(chǎn)胞外COD的影響。在發(fā)酵過程中,菌體生物量和胞外COD的總體變化趨勢一致,均呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢。發(fā)酵液起始pH為6.8時(shí),最有利于胞外COD的積累,其最大值為1.14U/mL,表明該菌株在中性偏酸的環(huán)境下更有利于胞外COD的合成。攪拌速率為250r/min時(shí),更有利于胞外COD的生成。

本實(shí)驗(yàn)中,DO對(duì)SG03菌株合成胞外COD具有重要影響,在單一DO控制實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上,提出了兩階段DO控制策略,顯著提高了胞外COD產(chǎn)量和生產(chǎn)效率,最大COD產(chǎn)量和COD生產(chǎn)率分別達(dá)到了1.38U/mL和0.03U/mL·h。在其它微生物發(fā)酵研究中,也有報(bào)道DO兩階段控制措施的有效性,但具體措施有所不同。在Aspergillusflavus發(fā)酵生產(chǎn)Kojic acid中,Ariff等基于氧限制有利于Kojic acid生產(chǎn)率的提高,提出了兩階段DO控制提高Kojic acid產(chǎn)量的策略[14]。在Torulopsisglabratausting發(fā)酵生產(chǎn)丙酮酸中,Li等通過采用兩階段氧供應(yīng)(改變攪拌速度),顯著提高了丙酮酸的生產(chǎn)率[15]。

[1]馬玉超. 微生物膽固醇氧化酶的研究進(jìn)展[J]. 北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2012,34(6):148-151.

[2]Vrielink A,Ghisla S. Cholesterol oxidase:biochemistry and structural features[J]. FEBS Journal,2009,276(23):6826-6843.

[3]Doukyu N. Characteristics and biotechnological applications of microbial cholesterol oxidase[J]. Applied Microbiology and Biotechnology,2009,83(5):825-837.

[4]Purcell J P,Greenplate J T,Jennings M J,etal. Cholesterol oxidase:A potent insecticidal active against boll weevil larvae[J].Biochemical and Biophysical Research Communications,1993,196(3):1406-1413.

[5]Corbin D R,Grebenok R J,Ohnmeiss T H,etal. Expression and chloroplast targeting of cholesterol oxidase in transgenic tobacco plants[J]. Plant Physiology,2001,126(3);1116-1128.

[6]張玲,楊海麟,孫燕,等. 微生物膽固醇氧化酶的研究進(jìn)展[J]. 食品科學(xué),2009,30(9):225-229.

[7]桑吉,王龍剛,李忠琴,等. 膽固醇氧化酶高產(chǎn)菌株的復(fù)合誘變選育[J]. 食品工業(yè)科技,2006,27(6):87-89.

[8]許曉燕,張銳,譚曉晶,等. 膽固醇氧化酶的發(fā)酵條件及酶學(xué)性質(zhì)研究[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè),2006,32(2):41-45.

[9]王瓊,霍影,汪靜,等. 一株膽固醇氧化酶高產(chǎn)菌的分類鑒定及酶學(xué)特性的研究[J]. 四川師范大學(xué)學(xué)報(bào),2013,36(6):930-935.

[10]Sun Y,Yang H L,Wang W. Improvement of the thermostability and enzymatic activity of Cholesterol oxidase by site-directed mutagenesis[J]. Biotechnology Letters,2011,33(10):2049-2055.

[11]黃寅,葛飛,陶玉貴,等. 膽固醇氧化酶高產(chǎn)菌株的誘變選育及產(chǎn)酶條件優(yōu)化[J]. 安徽工程科技學(xué)院學(xué)報(bào),2009,24(4):8-11.

[12]Pefia A,Pardo J P,Ramirez J. Early metabolic effects and mechanism of ammonium transport in yeast[J]. Archives of Biochemistry and Biophysics,1987,253(2):431-438.

[13]Mcdermott J F,Lethbridge G,Bushell M E. Estimation of the kinetic constants and elucidation of trends in growth and erythromycin production in batcn and continuous cultures of Saccharopolyspora erythraea using curve-fitting techniques[J]. Enzyme and Microbial Technology,1993,15(8):657-663.

[14]Ariff A B,Salleh MS,Ghani B,etal. A eration and yeast extract requirements for kojic acid produntion byAapergillusflavuslink[J]. Enzyme and Microbial Technology,1996,19:545-550.

[15]Li Y,Hugenholtz J,Chen J,etal. Enhancement of pyruvate production by Torulopsis glabata using a two-stage oxygen supply control strategy[J]. Appl Microb Biotenchnol,2002,60:101-106.

Fermentation conditions optimization of cholesterol oxidase in the broth byBacilluscereusSG03 in a 10L fermentor

GEFei1,GONGQian1,ZHANGHui-min1,HUANGYin1,SHIBei-jie1,GUILin2,*

(1.Department of Biological and Chemical Engineering,Anhui Polytechnic University,Wuhu 241000,China;2.Department of Microbiology and Immunology,Wannan Medical College,Wuhu 241000,China)

Objective:The technique of producing cholesterol oxidase by the strain ofBacilluscereusSG03 in a 10L fermenter was optimized,in order to provide the basis for further application of the strain. Methods:The effect of pH of the culture medium,stirring rate and DO on the production of cholesterol oxidase in the broth byBacilluscereusSG03 was studied in a 10L fermentor. Results:The optimum fermentation conditions were initial pH at 6.8,stirring rate at 250r/min and DO at 80%. Based on the results,a strategy of two stage DO manipulation was proposed,controlling DO at 90% before the 20h and at 20% from the 20h to at the end during the fermentation. The maximum COD activity in the broth and production efficiency reached 1.38U/mL and 0.03U/(mL·h),respectively improved 30.2% and 20.0% higher than with one stage manipulation.

Bacilluscereus;cholesterol oxidase;fermentor；two stage DO manipulation

2014-02-10 *通訊聯(lián)系人

葛飛(1978-)，男，副教授，主要從事微生物資源開發(fā)與利用研究。

安徽省高等學(xué)校優(yōu)秀青年人才基金項(xiàng)目(2011SQRL079)；安徽省高等學(xué)校省級(jí)自然科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(KJ2013A049)。

TS201.3

A

1002-0306(2014)17-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2014.17.001