,,,

(大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,遼寧大連 116600)

蔬菜中沙門氏菌生長(zhǎng)特性的研究

冮潔,余鴻儒,武曉松,胡文忠

(大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,遼寧大連 116600)

以菠菜、香菜和櫻桃番茄為實(shí)驗(yàn)材料,通過(guò)人工回接鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium),研究沙門氏菌在蔬菜上的生長(zhǎng)特性。結(jié)果表明,沙門氏菌能夠在上述3種蔬菜上侵染并大量繁殖。沙門氏菌在蔬菜上的生長(zhǎng)情況受到溫度和種類的影響,在25℃時(shí),在櫻桃番茄上的沙門氏菌生長(zhǎng)量最大,為2.45×104cfu/g；而在4℃時(shí),在香菜上生長(zhǎng)的沙門氏菌量最大,菌數(shù)為7.5×103cfu/g。沙門氏菌的繁殖量隨回接濃度增大而增大,但當(dāng)回接濃度大于15cfu/g時(shí),沙門氏菌生長(zhǎng)會(huì)受到抑制。在回接菌后4～8h會(huì)出現(xiàn)一個(gè)沙門氏菌繁殖的高峰,隨后在8～10h菌數(shù)明顯下降,說(shuō)明沙門氏菌一旦侵染蔬菜會(huì)在短時(shí)間內(nèi)快速增長(zhǎng),12h后沙門氏菌繁殖量呈明顯下降趨勢(shì),可能與致腐菌開始大量繁殖導(dǎo)致蔬菜失水、腐爛有關(guān)。

鼠傷寒沙門氏菌,香菜,櫻桃番茄,菠菜,生長(zhǎng)曲線

沙門氏菌(Salmonella)是一群寄生于人和動(dòng)物腸道內(nèi)的無(wú)芽孢革蘭氏陰性直桿菌,其菌型繁多,分布廣泛,是一種重要的引起食源感染性腹瀉的致病微生物。在世界各地的食物中毒病例中,由沙門氏菌引起的位居前列,已嚴(yán)重威脅著消費(fèi)者的身體健康,造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。在歐洲,每年有超過(guò)16萬(wàn)人感染沙門氏菌,發(fā)生率約為0.035%[3]。在美國(guó),每年有超過(guò)140萬(wàn)人感染沙門氏菌,直接經(jīng)濟(jì)損失超過(guò)24億美元[4]。在中國(guó),每年由沙門氏菌造成的食物中毒事件占到全部食物中毒事件的40%～60%[5-6]。近年來(lái),由于追求營(yíng)養(yǎng)和口感,中式餐飲和西式餐飲中生食蔬菜消費(fèi)品種、消耗量及消費(fèi)人群均呈擴(kuò)大和上升的趨勢(shì),安全問(wèn)題也日趨受到關(guān)注[7]。然而當(dāng)前人們對(duì)蔬菜衛(wèi)生的要求主要著眼于蔬菜的農(nóng)藥殘留、重金屬的檢測(cè)以及無(wú)公害蔬菜產(chǎn)地環(huán)境條件的規(guī)范,而對(duì)蔬菜的病原菌污染研究較少,至今沒有新鮮蔬菜微生物的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。蔬菜受病原菌污染可直接影響到廣大消費(fèi)者的健康,是消費(fèi)者腸道傳染病的重要媒介[8-9]。肉、蛋、奶等營(yíng)養(yǎng)豐富動(dòng)物性的食品是沙門氏菌主要傳播媒介[10-14]。但對(duì)蔬菜的病原微生物監(jiān)測(cè)中,也多次檢測(cè)出沙門氏菌的存在。方敏等從武漢市胡蘿卜樣品中檢出德爾卑沙門菌(Salmonelladerby)[15]。李秀桂等從南寧市生食蔬菜464份中檢出11株沙門氏菌,陽(yáng)性率為2.37%,其中香菜、香蔥和生菜是受到污染主要品種；檢出的沙門氏菌共分6個(gè)血清型,阿貢納沙門氏菌是主要優(yōu)勢(shì)菌[16]。王清等人在四川省渠縣蔬菜類食品綠豆芽中檢出朗根薩爾查沙門氏菌[17]。黃志廣等人從佛山市高明區(qū)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)中的72個(gè)蔬菜樣品中分離出2株沙門氏菌,檢出率為2.78%[18]。并且,也有因?yàn)槭秤帽簧抽T氏菌污染的蔬菜而引起食物中毒的事件發(fā)生。2008年6月,美國(guó)疾病控制和預(yù)防中心發(fā)出警告,沙門氏菌病疫情蔓延16個(gè)州,感染者達(dá)160余人,報(bào)告要求人們避免進(jìn)食疑被沙門氏菌污染的一種紅色圓形類西紅柿,數(shù)千斤該種西紅柿緊急下架。2009年8月,四川省涼山會(huì)東縣發(fā)生疑似食物中毒事件,217人中毒1人死亡。據(jù)涼山州衛(wèi)生局檢測(cè)報(bào)告:1個(gè)涼拌菜樣品中檢出傷寒沙門氏菌。根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查、臨床表現(xiàn)和實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果認(rèn)定此次事件是沙門氏菌污染食物引起的食物中毒事件。因此,對(duì)蔬菜污染沙門氏菌的檢測(cè)和控制應(yīng)引起人們的足夠重視。本文選擇菠菜、香菜和櫻桃番茄作為樣品,通過(guò)人工回接染沙門氏菌。觀察不同溫度下、不同濃度的沙門氏菌在蔬菜樣品上的生長(zhǎng)情況。為控制蔬菜中沙門氏菌的污染,避免食物中毒的發(fā)生提供參考。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

菠菜、香菜、櫻桃番茄 購(gòu)自大連開發(fā)區(qū)大商新瑪特超市；鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium) 編號(hào):GIM1.237,購(gòu)自廣東省微生物菌種保藏中心；蛋白胨,胰蛋白胨,酵母膏,亞硫酸鉍(BS)瓊脂培養(yǎng)基等 購(gòu)自北京奧特星生物技術(shù)有限公司。

LB營(yíng)養(yǎng)肉湯固體培養(yǎng)基(g/L) 胰蛋白胨10,酵母膏5,氯化鈉10,瓊脂20,pH7.2,121℃滅菌30min備用。

BS瓊脂培養(yǎng)基(g/L) 蛋白胨10,牛肉膏5,葡萄糖5,亞硫酸鈉6,磷酸氫二鈉4,檸檬酸鉍銨2,硫酸亞鐵0.3,煌綠0.024,瓊脂20。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蔬菜上沙門氏菌菌數(shù)的計(jì)數(shù)方法 蔬菜樣品25g為一份,分別按0.15、1.5、15cfu/g的菌液濃度均勻涂在樣品上,然后分別放在4(冷藏)、25(室溫)、37℃(沙門氏菌最適生長(zhǎng)溫度)下保藏,前12h,每2h取一次樣,12h后,每12h取一次樣直至48h結(jié)束。

樣品無(wú)菌條件下剪碎后放入225mL無(wú)菌水中,充分振蕩搖勻后,取0.1mL樣液在BS培養(yǎng)基上均勻涂布,37℃培養(yǎng)48h,記錄菌落數(shù)。同時(shí)以不接沙門氏菌的蔬菜做為空白樣品。

1.2.2 櫻桃番茄表面菌數(shù)的計(jì)數(shù)方法 樣品的準(zhǔn)備和接菌按上述1.2.1相同方法操作,只是取25g樣后不經(jīng)剪碎,而是直接放入225mL無(wú)菌水中,充分振蕩搖勻,洗掉櫻桃番茄表面粘附的沙門氏菌后,取0.1mL液體在BS培養(yǎng)基上均勻涂布,37℃培養(yǎng)48h,記錄菌落數(shù)。

1.3數(shù)據(jù)分析

每個(gè)實(shí)驗(yàn)處理3次重復(fù),用Microsoft Excel軟件計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與討論

2.1沙門氏菌在菠菜上的生長(zhǎng)特性

由圖1可見,菠菜在4℃保藏時(shí),接種量為0.15cfu/g和1.5cfu/g的樣品,前4h沙門氏菌菌數(shù)逐漸增大,而接種量為15cfu/g的樣品,前6h沙門氏菌在菠菜上菌數(shù)逐漸增大,隨后菌數(shù)都逐漸減少。接種濃度為1.5cfu/g,在4h時(shí)菌數(shù)達(dá)最大,為4.6×103cfu/g。從圖2可見,菠菜在25℃保藏時(shí),前6h沙門氏菌在菠菜上菌數(shù)逐漸增大,接種濃度為1.5cfu/g,在6h時(shí)菌數(shù)達(dá)最大,為2.03×104cfu/g,比在4℃保藏時(shí)的最大菌數(shù)增加4.41倍。在4℃保藏時(shí),沙門氏菌依然能夠生長(zhǎng),但生長(zhǎng)速度較慢,在25℃時(shí),生長(zhǎng)速度加快?；亟訚舛扔绊懮抽T氏菌的繁殖,由于蔬菜中可供沙門氏菌利用的營(yíng)養(yǎng)成分的限制,并不是回接菌數(shù)越大,沙門氏菌繁殖量越大。由于在37℃保藏時(shí),菠菜腐爛情況嚴(yán)重,因此沒有研究在37℃時(shí)沙門氏菌在菠菜上的生長(zhǎng)特性。

2.2沙門氏菌在香菜上的生長(zhǎng)特性

從圖3中可以看出,香菜在4℃保藏時(shí),接種量為0.15cfu/g和1.5cfu/g的樣品,前4h沙門氏菌菌數(shù)逐漸增大,而接種量為15cfu/g的樣品,沙門氏菌在前6h生長(zhǎng)速度較快,在6h達(dá)到最大菌數(shù)為7.5×103cfu/g。而在25℃保藏時(shí)(圖4),沙門氏菌的生長(zhǎng)速度更加加快,接種量為0.15cfu/g和1.5cfu/g的樣品,前4h沙門氏菌菌數(shù)逐漸增大,而接種量為15cfu/g的樣品,前8h菌數(shù)逐漸增加；接種量為0.15cfu/g時(shí),在4h時(shí),最大菌數(shù)可達(dá)1.64×104cfu/g(25℃),比4℃保藏時(shí),相同接種濃度、相同時(shí)間情況下,菌數(shù)增加3.49倍。香菜和菠菜等綠葉蔬菜,在37℃保藏時(shí),腐爛情況嚴(yán)重,因此沒有研究在37℃時(shí)沙門氏菌在香菜上的生長(zhǎng)特性。

圖3 沙門氏菌在香菜上的生長(zhǎng)曲線(4℃)Fig.3 The growth curve of Salmonella in parsley(4℃)

圖4 沙門氏菌在香菜上的生長(zhǎng)曲線(25℃) Fig.4 The growth curve of Salmonella in parsley(25℃)

2.3沙門氏菌在櫻桃番茄上的生長(zhǎng)特性

從圖5中可以看出,沙門氏菌在櫻桃番茄中的生長(zhǎng)情況,在4℃保藏時(shí),接種量為0.15cfu/g和1.5cfu/g的樣品,前4h沙門氏菌菌數(shù)逐漸增大,而接種量為15cfu/g的樣品,沙門氏菌在前6h生長(zhǎng)速度較快,接種量是0.15cfu/g和1.5cfu/g時(shí),在4h時(shí),菌數(shù)就達(dá)到最大值,分別為3.8×103cfu/g和5.2×103cfu/g;當(dāng)接種量是15cfu/g時(shí),在6h達(dá)到最大菌數(shù)為3.0×103cfu/g。而在25℃保藏時(shí)(圖6),接種量為1.5cfu/g和15cfu/g的樣品,前4h沙門氏菌菌數(shù)逐漸增大,而接種量為0.15cfu/g的樣品,在前6h菌數(shù)逐漸增大。接種量為1.5cfu/g,在4h時(shí),最大菌數(shù)可達(dá)2.45×104cfu/g(25℃),比同樣的接種量,在4℃時(shí),同樣時(shí)間,菌數(shù)增加4.71倍。

圖5 沙門氏菌在櫻桃番茄上的生長(zhǎng)曲線(4℃)Fig.5 The growth curve of Salmonella in cherry tomatoes(4℃)

圖6 沙門氏菌在櫻桃番茄上的生長(zhǎng)曲線(25℃)Fig.6 The growth curve of Salmonella in cherry tomatoes(25℃)

對(duì)沙門氏菌在櫻桃番茄上的生長(zhǎng)情況,除了在上述4℃和25℃保藏外,由于櫻桃番茄在37℃時(shí)腐爛情況較輕,還研究了在37℃時(shí)沙門氏菌生長(zhǎng)情況(圖7)。37℃是沙門氏菌最適宜生長(zhǎng)溫度。因此,研究了沙門氏菌在37℃時(shí)在櫻桃番茄內(nèi)部和表面生長(zhǎng)情況(圖8)。從圖7中可以看出,取樣后櫻桃番茄沒有剪碎,只計(jì)數(shù)櫻桃番茄表面的沙門氏菌數(shù)時(shí),接種濃度為0.15cfu/g,在4h時(shí),最大菌數(shù)為5.5×103cfu/g。而從圖8中可見,取樣后將櫻桃番茄剪碎,計(jì)算表面和內(nèi)部的沙門氏菌,接種濃度同樣為0.15cfu/g,在4h時(shí),最大菌數(shù)達(dá)9.8×103cfu/g,比櫻桃番茄表面的沙門氏菌數(shù)增加1.78倍,說(shuō)明沙門氏菌可以侵入到櫻桃番茄內(nèi)部,且在櫻桃番茄內(nèi)部生長(zhǎng)繁殖。

圖7 沙門氏菌在櫻桃番茄表面的生長(zhǎng)曲線(37℃)Fig.7 The growth curve of Salmonella on cherry tomatoes surface(37℃)

圖8 沙門氏菌在櫻桃番茄內(nèi)部和表面生長(zhǎng)曲線(37℃)Fig.8 The growth curve of Salmonella in internal and surface of cherry tomatoes(37℃)

3 結(jié)論

沙門氏菌在上述菠菜、香菜和櫻桃番茄等3種蔬菜上侵染后能夠大量繁殖。沙門氏菌在蔬菜上的生長(zhǎng)情況受到溫度的影響,常溫(25℃)條件下3種蔬菜污染的最大菌數(shù)可達(dá)104cfu/g,冷藏(4℃)條件下蔬菜污染的最大菌數(shù)為103cfu/g,說(shuō)明常溫條件更適合沙門氏菌的繁殖,因此,蔬菜運(yùn)輸和保藏應(yīng)選在低溫條件下。相同溫度下,各蔬菜的污染最大菌數(shù)有一定差異。4℃條件下,香菜的污染菌數(shù)最大,而25℃條件下櫻桃番茄的污染菌數(shù)最大。沙門氏菌在蔬菜上的生長(zhǎng)情況也受到回接菌濃度的影響,一定濃度下沙門氏菌的繁殖量隨回接濃度增大而增大,但當(dāng)回接濃度大于15cfu/g時(shí),沙門氏菌生長(zhǎng)會(huì)受到抑制,生長(zhǎng)速度和繁殖量下降。在回接4～8h會(huì)出現(xiàn)一個(gè)沙門氏菌繁殖量的高峰,隨后明顯下降,說(shuō)明沙門氏菌一旦侵染蔬菜會(huì)在短時(shí)間內(nèi)快速增長(zhǎng)。因此對(duì)于蔬菜來(lái)說(shuō),沙門氏菌的防控應(yīng)在采摘后及時(shí)進(jìn)行,以避免接觸沙門氏菌污染源后沙門氏菌在蔬菜上迅速繁殖。通過(guò)對(duì)櫻桃番茄樣品剪碎處理和未剪碎處理實(shí)驗(yàn)的對(duì)比可知,沙門氏菌可以侵入到櫻桃番茄內(nèi)部,且在櫻桃番茄內(nèi)部生長(zhǎng)繁殖。12h后沙門氏菌繁殖量呈明顯下降趨勢(shì),可能與致腐菌開始大量繁殖導(dǎo)致蔬菜失水、腐爛有關(guān)。

[1]馬兆飛,李潔莉,胡紅琴,等.PCR和實(shí)時(shí)PCR技術(shù)快速檢測(cè)牛奶樣品中的沙門氏菌[J].中國(guó)食品學(xué)報(bào),2008,8(5):132-137.

[2]杜雄偉,李葉,冮潔,等.肉制品中沙門氏菌invA基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立[J].食品工業(yè)科技,2013,34(12):68-70.

[3]Mc Guinness S,McCabe e,O’Regan E,etal. Development and validation of a rapid real-time PCR based method for the specific detection ofSalmonellaon fresh meat[J]. Meat Sci,2009,83(3):555-562.

[4]Hong Y,Berrang M E,Liu T,etal. Rapid detection of CampylobactercoliC.jejuni,andSalmonellaentericaon poultry carcasses by using PCR-enzyme-linked immunosorbent assay[J].Appl Environ Microbiol,2003,69(6):3492-3499.

[5]滕要輝,索標(biāo),艾志錄,等.速凍食品中沙門氏菌和金黃色葡萄球菌多重PCR檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用[J].食品科學(xué),2013,34(8):140-144.

[6]童哲,程蘇云,梅玲玲. 浙江省272份食品沙門氏菌檢測(cè)結(jié)果[J]. 浙江預(yù)防醫(yī)學(xué),2003,15(4):33-34.

[7]高銘營(yíng),李寶聚,石延霞,等.鮮食蔬菜中食源性病原菌污染及防控[J].中國(guó)食物與營(yíng)養(yǎng),2009,5:9-11.

[8]Neal J A,Marquez-Gonzalez M,Cabrera-Diaz E,etal. Comparison of multiple chemical sanitizers for reducingSalmonellaandEscherichiacoliO157∶H7 on spinach leaves[J]. Food Research International,2012,45:1123-1128.

[9]秦田秀. 桂林市2008-2011 年市售食品中食源性致病菌調(diào)查[J]. 中國(guó)熱帶醫(yī)學(xué),2013,13(4):444-446.

[10]徐桂云,樊世杰.家禽沙門氏菌感染現(xiàn)狀及不同國(guó)家的防治策略[J].中國(guó)家禽,2012,34(9):7-12.

[11]劉喆,張書蕭,王少輝,等.沙門氏菌的檢測(cè)技術(shù)進(jìn)展[J].中國(guó)動(dòng)物傳染病學(xué)報(bào),2012,20(2):81-86.

[12]Sy K V,Murray M B,Harrison M D,etal. Evaluation of gaseous chlorine dioxide as a sanitizer for killingSalmonella,EscherichiacoliO157∶H7,Listeriamonocytogenesand yeasts and molds on fresh and fresh-cut produce[J]. Journal of Food Protection,2005,68(6):1176-1187.

[13]Ukuku D O,Bari M,Kawamoto S,etal. Use of hydrogen peroxide in combination with nisin,sodium lactate and citric acid for reducing transfer of bacterial pathogens from whole melon surfaces to fresh-cut pieces[J]. International Journal of Food Microbiology,2005,104(2):225-233.

[14]劉仲敏,鄭鳴,王永芬,等.食源性沙門氏菌實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)研究[J]. 食品工業(yè)科技,2007,28(8):233-236.

[15]方敏,鄭華英,郭愛玲,等.自市售生食蔬菜胡蘿卜中檢出沙門菌報(bào)告[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2006,16(12):1537.

[16]李秀桂,黃彥,唐振柱,等.南寧市生食蔬菜中病原菌污染監(jiān)測(cè)[J]. 應(yīng)用預(yù)防醫(yī)學(xué),2008,14(6):361-363.

[17]王清,王小林,鄭國(guó)順,等.在蔬菜類食品中檢出朗根薩爾查沙門氏菌分析[J].中國(guó)保健營(yíng)養(yǎng),2013,1:40-41.

[18]黃志廣,莫嘉延,李鳳貞.佛山市高明區(qū)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)中食源性沙門氏菌血清型與耐藥性現(xiàn)狀[J]. 公共衛(wèi)生與預(yù)防醫(yī)學(xué),2012,23(6):6-9.

Research onSalmonellagrowthcharacteristics in vegetables

GANGJie,YUHong-ru,WUXiao-song,HUWen-zhong

(College of Life Sciences,Dalian Nationalities University,Dalian 116600,China)

Using spinach,coriander and cherry tomato as material,through artificial inoculationSalmonellatyphimurium,the growth characteristics ofSalmonellain vegetables were studied. The results showed thatSalmonellacould infect and bloom the above three kinds of vegetables.Salmonellagrowth in the vegetables were influenced by temperature and species. The maximum number ofSalmonellagrowth at 25℃ reached 2.45×104cfu/g in cherry tomato,and that at 4℃reached 7.5×103cfu/g in parsley.Salmonellagrowth in vegetables also were affected by the concentration of artificial inoculation. Under certain circumstances,the more artificial inoculation concentration,the more concentration ofSalmonellagrew. However,when the artificial inoculation concentration was higher than 15cfu/g,Salmonellagrowth would be inhibited. After inoculation,salmonellabred to reach a peak in 4～8h,decreased significantly in 8～10h,indicating thatSalmonellaonce infected vegetables would rapidly grow in a short time. After 12h,Salmonellareproductive output was significantly decreased,while the bacteria begin to multiply rapidly in vegetables,resulting in their water loss and decay.

Salmonellatyphimurium; parsley;cherry tomato;spinach;growth curve

2013-12-02

冮潔(1965-),女,博士,教授,研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。

“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國(guó)家科技計(jì)劃課題(2012BAD38B05)。

TS255.1

A

1002-0306(2014)17-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2014.17.001