林清認(rèn)，周霞

（浙江省腫瘤醫(yī)院 放療科，浙江 杭州 310022）

姜黃素對(duì)肺癌細(xì)胞的放療增敏作用及機(jī)制研究

林清認(rèn)，周霞Δ

（浙江省腫瘤醫(yī)院 放療科，浙江 杭州 310022）

目的觀察姜黃素對(duì)肺癌NCI-H446細(xì)胞的體外放療增敏作用，探討其可能的機(jī)制。方法體外培養(yǎng)肺癌NCI-H446細(xì)胞，分為對(duì)照組、姜黃素處理組、X射線干預(yù)組以及聯(lián)合干預(yù)組。對(duì)照組僅給予等體積培養(yǎng)基，姜黃素處理組給予不同濃度姜黃素處理48 h，X射線組采用X射線照射（劑量率250 cGy／min），聯(lián)合治療組細(xì)胞先采用姜黃素處理，之后使用X射線照射。采用MTT法檢測(cè)各處理組細(xì)胞增殖情況，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，Western blot檢測(cè)細(xì)胞中p53、p21、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)。結(jié)果不同濃度的姜黃素對(duì)人肺癌NCI-H446細(xì)胞生長(zhǎng)具有抑制作用；劑量為6～12 Gy的X線處理后，也可顯著抑制NCI-H446細(xì)胞增殖；不同濃度姜黃素和8Gy X線處理后，NCI-H446細(xì)胞增殖進(jìn)一步降低，并與姜黃素濃度呈一定的劑量依賴(lài)性。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示：姜黃素和X射線照射均可促進(jìn)細(xì)胞凋亡；2者聯(lián)合使用與單純姜黃素或X射線照射相比細(xì)胞凋亡顯著增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Western blot結(jié)果顯示：姜黃素與X射線均能誘導(dǎo)NCI-H446細(xì)胞中p53、p21和Bax蛋白表達(dá)，降低Bcl-2蛋白表達(dá)（P＜0.05）。X射線與姜黃素聯(lián)合處理后，p53、p21和Bax以及Bcl-2蛋白含量比單獨(dú)作用變化顯著，差異有統(tǒng)計(jì)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論姜黃素對(duì)人NCI-H446細(xì)胞具有放療增敏作用，其機(jī)制與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，上調(diào)p53、p21蛋白及下調(diào)Bcl-2／Bax表達(dá)有關(guān)。

姜黃素；肺癌細(xì)胞；放療

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 姜黃素（Sigma-Adrich，純度≥95%），用二甲基亞砜（DMSO）溶解；細(xì)胞培養(yǎng)基購(gòu)自Invitrogen公司、細(xì)胞蛋白提取試劑盒購(gòu)自 Thermo；碘化丙啶（PI）購(gòu)自Sigma-Adrich，抗人 p53、p21、Bax和 Bcl-2抗體購(gòu)自 Santa Cruz；ECl化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自Amersham Pharmacia公司；MTT試劑盒購(gòu)自江蘇碧云天生物技術(shù)有限公司。主要儀器：流式細(xì)胞儀（FACSCalibur system，BD），分 光 光 度 計(jì) （BioPhotometer spectrophotometer，Eppendorf），醫(yī) 用 加 速 器 （Clinac 600 C／D，Varianmedical systems）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及活性檢測(cè) 人小細(xì)胞NCI-H446肺癌細(xì)胞株（中南大學(xué)腫瘤研究所提供）用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基于37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)。分別設(shè)立對(duì)照組、姜黃素處理組、X射線干預(yù)組以及聯(lián)合干預(yù)組。對(duì)照組不做處理，姜黃素處理組給予25μmol／L處理48 h，X射線組采用X射線照射（劑量率250 cGy／min），聯(lián)合干預(yù)組給予不同濃度姜黃素和X射線。MTT法檢測(cè)姜黃素對(duì)NCI-H446細(xì)胞增殖的影響。取不同濃度姜黃素和不同劑量X射線處理后的NCI-H446細(xì)胞，每孔加入30μLMTT溶液（1 g／L），37℃孵育 2 h后棄上清，加入200μL DMSO，充分混勻，用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔吸光度值（A570），計(jì)算抑制率。抑制率＝（對(duì)照組A值-實(shí)驗(yàn)組A值）／對(duì)照組A值×100%。取抑制率為20%～30%時(shí)的姜黃素濃度和射線劑量進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞凋亡檢測(cè) NCI-H446細(xì)胞孵育結(jié)束后，棄上清，PBS輕洗2次，重懸制備單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞密度至5×105個(gè)／mL。取1mL細(xì)胞，1 000 r／min離心 5 min，離心棄上清；用195μL Binding Buffer輕重懸并加入5μL Annexin-V／FITC輕混勻，室溫避光孵育 10 min；1000r／min離心 5 min，沉淀加入190μL Annexin-V／FITC結(jié)合液輕重懸細(xì)胞，再加入10μL PI輕輕混勾，冰浴避光反應(yīng)10min后用于流式細(xì)胞術(shù)分析。

1.4 Western blot 細(xì)胞處理完畢后，800 r／min離心5 min，棄上清，用冰冷的PBS洗滌細(xì)胞2次。加入200μL細(xì)胞裂解緩沖液重懸浮細(xì)胞，冰上裂解40min。1 000 r／min離心15min后，上清即為細(xì)胞總蛋白。對(duì)于細(xì)胞漿蛋白提取，將細(xì)胞沉淀每20 μL細(xì)胞沉淀的體積，加入200μL預(yù)冷的溶液A工作液，最大轉(zhuǎn)速渦旋劇烈振蕩10 s。放置冰上10～15 min。隨后加入11μL冷溶液B，渦旋劇烈振蕩5 s，冰上裂解1min。再次振蕩5 s后，4℃離心5min。上清即為細(xì)胞漿蛋白。上述蛋白經(jīng)5%～15%SDS-PAGE后，Western blot檢測(cè) p53、p21、Bax和 Bcl-2的表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料采用單因素方差分析，兩組間比較用t檢驗(yàn)；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度姜黃素對(duì)NCI-H446細(xì)胞增殖的影響 陰性對(duì)照組NCI-H446細(xì)胞增殖活躍。用不同濃度的姜黃素作用24～72 h后，NCI-H446細(xì)胞增殖均受到不同程度的抑制（見(jiàn)圖1）。根據(jù)K?rber法，24 h姜黃素的半數(shù)抑制濃度（IC50）為224.5μg／mL，48 h的 IC50為64.3μg／mL。選取48 h NCI-H446細(xì)胞抑制率為20%～30%的姜黃素濃度（20μmol／L）進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 不同濃度姜黃素對(duì)NCI-H446細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用Fig.1 Effect of different concentration of curcumin on the viability of NCI-H446 cell

2.2 不同劑量X射線對(duì)NCI-H446細(xì)胞增殖的影響 當(dāng)輻射強(qiáng)度在12 Gy以內(nèi)時(shí)，隨著射線強(qiáng)度的增加以及照射時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)NCI-H446細(xì)胞的抑制率也進(jìn)一步增加（見(jiàn)圖2）。24 h輻射的IC50為18.4Gy，48 h的IC50為14.8Gy，選取抑制率為20%～30%時(shí)的輻射劑量（8 Gy）用于下一步實(shí)驗(yàn)。

圖2 不同強(qiáng)度X線對(duì)NCI-H446細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用Fig.2 Effect of different intensity of X-ray on the viability of NCI-H446 cell

2.3 姜黃素對(duì)NCI-H446細(xì)胞的放射增敏作用 MTT結(jié)果顯示：8Gy X射線組處理48 h時(shí)對(duì)NCI-H446細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率為（27.8±3.4）%。分別用 5、10、20μmol／L濃度姜黃素聯(lián)合干預(yù)后，肺癌NCI-H446細(xì)胞的增殖抑制率隨著姜黃素濃度的增加逐漸升高，與單用姜黃素組、X射線組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，見(jiàn)圖3）。

圖3 不同強(qiáng)度X線和姜黃素對(duì)NCI-H446細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用**P＜0.01，與20μmol／L姜黃素相比；＃＃P＜0.01，與8 Gy X-射線相比Fig.3 Effect of different intensity of X-ray and curcumin on the viability of NCI-H446 cell**P＜0.01，compared with 20μmol／L curcumin；＃＃P＜0.01，compared with 8Gy X-ray

2.4 姜黃素聯(lián)合X射線對(duì)NCI-H446細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示：盡管姜黃素處理48 h和8 Gy X射線處理均可促進(jìn)NCI-H446細(xì)胞凋亡，但2者聯(lián)合處理后，隨著姜黃素濃度的遞增，凋亡抑制率逐漸增高，與單用20μmol／L姜黃素或8Gy射線相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見(jiàn)圖4）。

圖4 不同強(qiáng)度X線和姜黃素對(duì)NCI-H446細(xì)胞凋亡的影響*P＜0.05，與 20μmol／L姜黃素相比；＃P＜0.05，與 8Gy X-射線相比Fig.4 Effect of different intensity of X-ray and curcumins on NCI-H446*P＜0.05，compared with 20μmol／L curcumin；*P＜0.01，compared with 8 Gy X-ray

2.5 凋亡相關(guān)蛋白含量檢測(cè) Western結(jié)果顯示放射線及姜黃素均能增加NCI-H446細(xì)胞p53、p21、Bax和Bcl-2蛋白的表達(dá)（P＜0.05）。而 2者聯(lián)合使用后，p53、p21、Bcl-2／Bax比值比單獨(dú)應(yīng)用的表達(dá)上升，作用顯著（P＜0.01，見(jiàn)圖5）。

圖5 不同強(qiáng)度X線和姜黃素對(duì)NCI-H446細(xì)胞凋亡基因表達(dá)的影響1.20μmol／L姜黃素；2.8 Gy X射線；3.8 Gy X射線 ＋5μmol／L姜黃素；4.8 Gy X射線 ＋10μmol／L姜黃素；5.8Gy X射線 ＋20μmol／L姜黃素*P＜0.05，與 X-ray組相比Fig.5 Effect of different intensity of X-ray and curcumin on apoptosis genes of the NCI-H4461.20μmol／L curcumin；2.8 Gy X-ray；3.8 Gy X-ray＋5μmol／L curcumin；4.8Gy X-ray＋10μmol／L curcumin；5.8Gy X-ray＋20μmol／L curcumin*P＜0.05，compared with X-ray group

3 討論

放療是肺癌的重要輔助治療方式。早在上個(gè)世紀(jì)五六十年代就有研究發(fā)現(xiàn)一些硝基咪唑類(lèi)化合物可有效增強(qiáng)放療的效果，但由于其神經(jīng)毒性太大而未能廣泛應(yīng)用于臨床。隨后又發(fā)現(xiàn)甲硝唑等一些化療藥物也能產(chǎn)生增敏效果，但依然因?yàn)椴涣挤磻?yīng)太大而使其應(yīng)用受到了限制［7-8］。因此尋求低毒的放療增敏劑，對(duì)于肺癌的治療非常重要。近年來(lái)姜黃素在腫瘤中的應(yīng)用受到眾多學(xué)者的關(guān)注。藥理學(xué)研究表明，姜黃素具有明確的抗腫瘤效應(yīng)，包括影響細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制血管發(fā)生、降低腫瘤細(xì)胞遷移與侵襲相關(guān)酶類(lèi)的表達(dá)，并對(duì)耐藥性腫瘤細(xì)胞有一定的逆轉(zhuǎn)作用［9-10］。以上藥理作用是本研究選擇姜黃素用于放療增敏劑的重要理論依據(jù)。

本研究首先通過(guò)MTT法對(duì)X射線和姜黃素作為單獨(dú)處理因素對(duì)NCI-H446細(xì)胞增殖與凋亡進(jìn)行了探討。結(jié)果表明姜黃素能以劑量和時(shí)間依賴(lài)性方式抑制NCI-H446細(xì)胞生長(zhǎng)增殖。與姜黃素類(lèi)似，X射線的一定劑量下，也具有類(lèi)似的抑制效應(yīng)。隨后根據(jù)姜黃素或X射線對(duì)細(xì)胞抑制率為20%～30%的濃度進(jìn)行了聯(lián)合干預(yù)，結(jié)果顯示，在X射線強(qiáng)度一致的情況下，細(xì)胞增殖抑制率以及凋亡率隨姜黃素濃度的增高而增加，較單純X射線或單純藥物處理差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。初步顯示出了姜黃素對(duì)小細(xì)胞肺癌NCI-H446細(xì)胞的放療增敏效應(yīng)。

為進(jìn)一步探討姜黃素與放療誘導(dǎo)NCI-H446細(xì)胞凋亡的機(jī)制，本研究對(duì)抑癌基因p53和p21進(jìn)行了檢測(cè)。細(xì)胞內(nèi)p53蛋白是最重要的抑癌基因，尤其是在修復(fù)DNA完整性方面發(fā)揮重要作用，防止癌變細(xì)胞的發(fā)生［11］。p21是位于p53基因下游的細(xì)胞周期素依賴(lài)性激酶抑制因子，與p53共同構(gòu)成細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)，從而阻滯細(xì)胞進(jìn)行正常有絲分裂，減少受損DNA復(fù)制，抑制細(xì)胞惡性增殖［12］。本研究證實(shí)，姜黃素和放療均可增加NCIH446細(xì)胞中的p53和p21蛋白的含量，2者聯(lián)合處理后，它們的表達(dá)量與單純X射線與姜黃素處理相比增加更顯著（P＜0.01）。由此推測(cè)姜黃素對(duì)肺癌細(xì)胞的放療增敏作用可能與上調(diào)抑癌基因p53和p21蛋白表達(dá)有關(guān)。

腫瘤治療的最終目標(biāo)是誘導(dǎo)其凋亡，在參與凋亡的眾多調(diào)節(jié)蛋白中，Bcl-2基因家族發(fā)揮著重要作用。Bax是該家族中重要的促凋亡蛋白，其可與Bcl-2結(jié)合形成異二聚體，從而抑制Bcl-2活性。通常以 Bcl-2／Bax的比值來(lái)反應(yīng)細(xì)胞凋亡情況［13-15］。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，姜黃素或放射組細(xì)胞中Bcl-2蛋白含量明顯減少，Bax蛋白含量明顯增加（P＜0.05）。姜黃素與放射聯(lián)合處理后，NCI-H446細(xì)胞中Bcl-2／Bax比值明顯降低（P＜0.01）。

綜上所述，本研究證實(shí)姜黃素對(duì)肺癌NCI-H446細(xì)胞具有一定的放療增敏作用。其增敏機(jī)制可能與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、以及上調(diào)p53、p2l蛋白表達(dá)、下調(diào)Bcl-2／Bax的比率有關(guān)。但具體的分子生物學(xué)機(jī)制還有待后續(xù)進(jìn)一步研究。

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（編校：吳茜）

Radiotherapy sensitization role of curcum in on lung cancer cells and itsmechanism

LIN Qing-ren，ZHOU XiaΔ

（Department of Radiotherapy，Tumor Hospital of Zhejiang Province，Hangzhou 310022，China）

ObjectiveTo observe the radiosensitizing effect of curcumin on lung cancer NCI-H446 cell in vitro and to investigate the possible mechanism.MethodsLung cancer NCI-H446 cell were cultured in vitro and divided into four groups：control group，curcumin group，X-ray group and combined intervention group.Control group was given equal volume ofmedium，curcumin group was treated with 20μmol／L curcumin for 48 h，X-ray group was irradiated by X-ray（dose rate was 250 cGy／min）and combined intervention group was treated with curcumin and X-ray.The proliferation of NCI-H446 cell in all groupswere detected by MTTmethod，cell apoptosiswere detected by flow cytometry and the protein expression of p53，p21，Bax，Bcl-2 were detected by Western blot.ResultsThe growth of human lung cancer NCI-H446 cellwere inhibited with different concentrations of curcumin and 6～12 Gy X-ray irradiation，and inhibited more in combined intervention group，in curcumin dose-dependentmanner.Flow cytometry results showed that，curcumin or X-ray irradiation could all induce apoptosis，the cell apoptosis increaced significantly when treated with both（P＜0.05）.Western blot results showed that，either curcumin or X-rays could induce p53，p21 and Bax protein expression in NCI-H446 cell and decrease Bcl-2 protein expression（P＜0.05）.After the combination of X-rays and curcumin，the content of p53，p21，Bax and Bcl-2 protein was significantly changed（P＜0.05）.ConclusionCurcumin has radiosensitizing effect on lung cancer NCI-H446 cell.The mechanism is connected with the inducing of apoptosis，increasing p53，p21 protein expression and decreasing the Bcl-2／Bax ratio.

curcumin；lung cancer cell；radiotherapy

R735

A

1005－1678（2014）05－0033－04

肺癌是威脅人類(lèi)生命和健康最嚴(yán)重的惡性腫瘤之一。美國(guó)2013年最新數(shù)據(jù)顯示，肺癌死亡病例達(dá)58萬(wàn)，居腫瘤病死亡率的首位［1］。非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是最常見(jiàn)的病理類(lèi)型（約占80%以上）。目前對(duì)于早期NSCLC，手術(shù)依然是主要的治療手段，但對(duì)于無(wú)法進(jìn)行手術(shù)或無(wú)法治愈的NSCLC而言，放射治療是重要的輔助治療手段［2］。放射治療可提高腫瘤的局部控制率，但依然受多種因素限制：①NSCLC患者往往機(jī)體抵抗力差，對(duì)放療劑量耐受性低［3］；②放療受腫瘤的組織學(xué)類(lèi)型的影響；③病灶周?chē)＝M織也無(wú)法耐受大劑量的放療。放療聯(lián)合抗腫瘤藥物可提高臨床療效，但不良反應(yīng)依然是臨床上面臨的主要問(wèn)題［4-5］。因此尋求不良反應(yīng)少，且能有效提高放療療效的藥物，是一種非常有前途的方案。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)許多中草藥提取物可有效提高腫瘤細(xì)胞對(duì)放療的敏感性，姜黃素就是其中一種［6］。本研究旨在觀察姜黃素對(duì)肺癌NCI-H446細(xì)胞的放療增敏作用，探討其可能的作用機(jī)制。

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生平臺(tái)骨干人才計(jì)劃（2011RCB008）

林清認(rèn)，男，碩士，住院醫(yī)師，研究方向：腫瘤放射治療，E-mail：linqingren1984＠163.com；周霞，通信作者，女，本科，副主任醫(yī)師，研究方向：腫瘤放射治療，E-mail：zhouxia197612＠163.com。