程鈺 王亮 田瑩 趙俊宏 曹燕 郭建強(qiáng)

視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cell，RGC)的凋亡和(或)死亡是青光眼不可逆性失明的主要病因[1]。N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid，NMDA)可與細(xì)胞表面的受體特異性結(jié)合，誘發(fā)細(xì)胞谷氨酸興奮性毒性和氧化應(yīng)激反應(yīng)[2]。槲皮素(Quercetin)是一種天然的黃酮類化合物，具有抗氧化、抗炎、抑制新生血管生成等作用[3]。研究表明，槲皮素能減輕過氧化氫誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞損傷，并通過抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、抗凋亡的機(jī)制發(fā)揮心血管保護(hù)作用[4-6]。本研究通過建立NMDA誘導(dǎo)小鼠RGC-5細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型，分析槲皮素對損傷后RGC的保護(hù)作用和機(jī)制，從而為青光眼的臨床治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料小鼠RGC-5細(xì)胞株、DMEM培養(yǎng)液(美國Gibco公司)；胎牛血清(杭州四季青公司)；兔抗小鼠Bcl-2、Bax、p38絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK)、磷酸化的p38 MAPK(phosphorylated p38 MAPK，p-p38 MAPK)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)、磷酸化的JNK(phosphorylated JNK，p-JNK)、β-actin抗體(美國Abcam 公司)；槲皮素(中國藥品生物制品檢定所)；茴香霉素(Anisomycin，ANISO)和 P79350(美國Calbiochem公司)；辣根過氧化物酶(horse radish peroxidase，HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗 (武漢博士德生物公司)；NMDA、噻唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)試劑盒和Caspase-3檢測試劑盒(美國Sigma公司)；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、活性氧(reactive oxygen species，ROS)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、一氧化氮 (nitric oxide，NO)檢測試劑盒(南京建成生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及藥物處理采用快速融化法復(fù)蘇細(xì)胞，用低糖(1 g·L-1)、含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、100 g·L-1雙抗的DMEM培養(yǎng)液，在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d用5 g·L-1胰蛋白酶消化傳代1次。取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實驗。所有實驗中，在NMDA(100 μmol·L-1)處理前，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至無血清培養(yǎng)基中饑餓24 h。

1.2.2 實驗分組將細(xì)胞分為對照組(不加任何干預(yù)因素)、NMDA組(在細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入終濃度為100 μmol·L-1的NMDA作用24 h)、NMDA+槲皮素處理組(加入終濃度分別為1 μmol·L-1、10 μmol·L-1、100 μmol·L-1的槲皮素預(yù)處理2 h后再加入終濃度為100 μmol·L-1的NMDA作用24 h)、槲皮素處理組(只加入10 μmol·L-1的槲皮素處理2 h)、NMDA+槲皮素+ ANISO / P79350處理組(加入終濃度為10 μmol·L-1的槲皮素預(yù)處理2 h后再加入終濃度為100 μmol·L-1的NMDA作用24 h，實驗結(jié)束前1 h加入25 μg·L-1的ANISO或50 μmol·L-1的P79350)。

1.2.3 MTT法檢測細(xì)胞存活情況各組細(xì)胞經(jīng)相應(yīng)處理后加入MTT溶液(5 g·L-1)10 μL，孵育4 h，棄上清，按每孔100 μL加入DMSO，振蕩10 min，酶標(biāo)儀490 nm處讀取吸光度(A值)。每個實驗組設(shè)置6個復(fù)孔。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率收獲細(xì)胞，用胰蛋白酶消化，制成懸浮細(xì)胞液，立即加入10 μL AnnexinⅤ-FITC和5 μL PI，振蕩混勻，避光，室溫孵育15 min后與300 μL的結(jié)合緩沖液混合加入流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測。

1.2.5 ELISA檢測LDH、SOD、ROS、MDA、NO水平將細(xì)胞接種于24孔板(每孔50×103個)，相應(yīng)藥物處理后，收集上清液，ELISA法檢測LDH、SOD、ROS、MDA、NO的濃度。具體操作依據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.6 Western blot檢測利用核蛋白/總蛋白裂解液裂解細(xì)胞、提取蛋白，SDS-PAGE電泳分離蛋白。電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，50 g·L-1脫脂奶粉封閉后，按照常規(guī)的方法加入兔抗小鼠Bcl-2、Bax、p38、p-p38、JNK、p-JNK、β-actin的抗體孵育，并加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗，Western blot檢測Bcl-2、Bax、p38、p-p38、JNK、p-JNK的蛋白表達(dá)，Scion Image圖像分析系統(tǒng)對所得條帶進(jìn)行分析，蛋白質(zhì)的相對含量以目的蛋白與β-actin條帶吸光度(A值)的比值表示。

1.2.7 RT-PCR檢測Bax、Bcl-2、nNOS和iNOS基因表達(dá)采用Trizol試劑提取各組細(xì)胞總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按試劑盒說明進(jìn)行，PCR擴(kuò)增引物采用引物在線軟件設(shè)計并檢測分析，最后由上海生物工程有限公司合成，Bax上游引物：5’-CTGGATCCAAGACCAGGGTG-3’，下游引物：5’-CTTCCAGATGGTGAGCGAGG-3’；Bcl-2上游引物：5’-CGTCGTGACTTCGCAGAGAT-3’，下游引物：5’-CAATCCTCCCCCAGTTCACC-3’；nNOS上游引物：5’-ATCCTCCCTCTGGAAGGACC-3’，下游引物：5’-TTGATGAAGGACTCGGTGGC-3’；iNOS上游引物：5’-GAGCAACTACTGCTGGTGGT-3’，下游引物：5’-CGATGTCATGAGCAAAGGCG-3’；β-actin上游引物：5’-AGGGAAATCGTGCGTGACAT-3’，下游引物：5’-AACCGCTCGTTGCCAATAGT-3’。每個樣本檢測均重復(fù)3次。

1.2.8 Caspase-3活性檢測胰蛋白酶消化貼壁細(xì)胞，收集至備用的細(xì)胞培養(yǎng)液中。600 r·min-14 ℃離心5 min收集細(xì)胞，小心吸除上清，PBS洗一次。吸盡上清后，加入裂解液冰浴裂解15 min。裂解后20 000 r·min-1離心10 min，取上清液至預(yù)冷的離心管中，加入預(yù)冷的Caspase 3底物Ac-DEVD-pNA (2 mmol·L-1)于37 ℃中孵育60 min顯色。同時設(shè)定空白對照，即只加入底物不加入樣品。反應(yīng)結(jié)束后，用酶標(biāo)儀檢測樣品和空白對照在405 nm處的吸光度(A值)，根據(jù)制定的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品的酶活力單位。然后利用Bradford法測量待測樣品的蛋白含量，計算單位質(zhì)量蛋白的酶活力單位。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，方差齊性資料應(yīng)用單因素方差分析組間比較(Bonferroni法)，方差不齊資料采用秩和檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 槲皮素對NMDA誘導(dǎo)的RGC-5細(xì)胞活性的影響與對照組比較，NMDA組、NMDA+1 μmol·L-1槲皮素處理組、NMDA+10 μmol·L-1槲皮素處理組細(xì)胞活性均明顯降低(均為P<0.05)，而LDH則明顯升高(均為P<0.05)。與對照組比較，槲皮素處理組細(xì)胞活性和LDH水平均無明顯變化(均為P>0.05)。與NMDA組比較，NMDA+10 μmol·L-1槲皮素處理組、NMDA+100 μmol·L-1槲皮素處理組、槲皮素處理組細(xì)胞活性均明顯增高(均為P<0.05)，而LDH則降低(均為P<0.05)。見表1。

2.2 槲皮素對NMDA誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激的影響與對照組比較，NMDA組和NMDA+槲皮素處理組ROS、MDA、NO、iNOS mRNA、nNOS mRNA均明顯升高，而SOD則降低(均為P<0.05)。與對照組比較，槲皮素處理組ROS、MDA、SOD、NO、iNOS mRNA、nNOS mRNA均無明顯變化(均為P>0.05)。與NMDA組比較，NMDA+槲皮素處理組和槲皮素處理組細(xì)胞ROS、MDA、NO、iNOS mRNA、nNOS mRNA則降低，而SOD則升高(均為P<0.05)。見表2、表3。

組別n細(xì)胞活性/%LDH/%對照組6100.0±7.1100.0±6.3NMDA組652.3±10.2?354.6±30.1?NMDA+1 μmol·L-1槲皮素處理組663.1±9.5?264.6±25.4?#NMDA+10 μmol·L-1槲皮素處理組676.2±8.3?#189.4±20.7?#NMDA+100 μmol·L-1槲皮素處理組686.6±6.7#142.0±23.2?#槲皮素處理組6109.9±11.8#95.3±8.9#F值17.31671.029P值0.0000.000

注：與對照組比較，*P<0.05；與NMDA組比較，#P<0.05

2.3 槲皮素對NMDA誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響與對照組比較，NMDA組和NMDA+槲皮素處理組Bcl-2 mRNA和蛋白表達(dá)降低，而Bax mRNA和蛋白表達(dá)、Caspase-3活性升高(均為P<0.05)。與對照組比較，槲皮素處理組Bcl-2 mRNA、Bax mRNA和Caspase-3活性均無明顯變化(均為P>0.05)，而Bcl-2蛋白表達(dá)升高(P<0.05)。與NMDA組比較，NMDA+槲皮素處理組和槲皮素處理組Bcl-2 mRNA和蛋白表達(dá)升高，而Bax mRNA和蛋白表達(dá)、Caspase-3活性均明顯降低(均為P<0.05)。見表4。

2.4 槲皮素抑制JNK/p38 MAPK信號通路活性與對照組比較，NMDA組和NMDA+槲皮素+ANISO處理組p-JNK蛋白表達(dá)升高，NMDA組和NMDA+槲皮素+P79350處理組p-p38 MAPK蛋白表達(dá)升高(均為P<0.05)。與NMDA組比較，NMDA+槲皮素處理組p-JNK蛋白和p-p38 MAPK蛋白表達(dá)降低(均為P<0.05)。與NMDA+槲皮素處理組比較，NMDA+槲皮素+ANISO處理組p-JNK蛋白表達(dá)升高(P<0.05)，NMDA+槲皮素+P79350處理組p-p38 MAPK蛋白表達(dá)升高(P<0.05)。見表5。

組別nROS/%MDA/%SOD/%NO/%對照組6100.0±4.3100.0±6.1100.0±4.3100.0±8.2NMDA組6318.5±25.6?251.8±23.4?52.0±9.7?301.6±29.0?NMDA+10 μmol·L-1槲皮素處理組6162.1±13.7?#157.6±18.3?#80.2±10.4?#198.8±17.3?#槲皮素處理組695.6±9.8#95.1±8.5#105.9±12.6#95.2±9.8#F值135.95364.23918.64487.704P值0.0000.0000.0010.000

注：與對照組比較，*P<0.05；與NMDA組比較，#P<0.05

與對照組比較，NMDA組、NMDA+槲皮素+ANISO處理組、NMDA+槲皮素+P79350處理組細(xì)胞活性明顯降低，細(xì)胞凋亡率和LDH則升高(均為P<0.05)。與對照組比較，NMDA+槲皮素處理組細(xì)胞活性變化不明顯(P>0.05)，而細(xì)胞凋亡率和LDH明顯增加(均為P<0.05)。與NMDA組比較，NMDA+槲皮素處理組細(xì)胞活性升高，細(xì)胞凋亡率和LDH降低(均為P<0.05)。與NMDA+槲皮素處理組比較，NMDA+槲皮素+ANISO處理組和NMDA+槲皮素+P79350處理組細(xì)胞活性降低，細(xì)胞凋亡率和LDH升高(均為P<0.05)。見表6。

組別niNOS mRNAnNOS mRNA對照組61.00±0.061.00±0.08NMDA組63.02±0.25?3.21±0.29?NMDA+10 μmol·L-1槲皮素處理組61.98±0.14?#2.04±0.22?#槲皮素處理組60.98±0.07#0.96±0.10#F值124.55291.102P值0.0000.000

注：與對照組比較，*P<0.05；與NMDA組比較，#P<0.05

組別nBcl-2 mRNA/%Bcl-2蛋白/%Bax mRNA/%Bax蛋白/%Caspase-3活性/%對照組61.00±0.031.00±0.051.00±0.061.00±0.03100.0±6.8NMDA組60.42±0.10?0.55±0.09?2.89±0.26?2.09±0.17?295.4±28.9?NMDA+10 μmol·L-1槲皮素處理組60.75±0.12?#0.91±0.08#1.73±0.15?#1.37±0.16?#189.2±20.5?#槲皮素處理組61.04±0.08#1.22±0.15?#0.96±0.10#0.93±0.09#97.1±10.7#F值30.84927.62994.21452.48274.305P值0.0000.0000.0000.0000.000

注：與對照組比較，*P<0.05；與NMDA組比較，#P<0.05

表5 RGC-5的p-JNK、p-p38 MAPK、JNK、p38 MAPK蛋白相對表達(dá)量

組別np-JNKJNKp-p38 MAPKp38 MAPK對照組61.00±0.081.00±0.061.00±0.071.00±0.07NMDA組63.02±0.31?1.09±0.072.98±0.13?1.01±0.03NMDA+10 μmol·L-1槲皮素處理組60.97±0.10#1.07±0.060.98±0.11#1.09±0.11槲皮素處理組60.92±0.11#1.03±0.070.89±0.13#1.08±0.09NMDA+槲皮素+ANISO處理組63.31±0.30?&1.04±0.071.02±0.06#1.09±0.08NMDA+槲皮素+P79350處理組61.03±0.08#1.04±0.053.01±0.27?&1.02±0.12F值169.2580.984158.3071.042P值0.0000.6570.0000.583

注：與對照組比較，*P<0.05；與NMDA組比較，#P<0.05；與NMDA+槲皮素處理組比較，&P<0.05

組別n細(xì)胞活性/%細(xì)胞凋亡率/%LDH/%對照組6100.0±10.1100.0±10.5100.0±11.1NMDA組652.5±8.2?302.4±30.1?301.7±30.7?NMDA+10 μmol·L-1槲皮素處理組684.2±12.6#170.5±20.1?#181.2±17.6?#槲皮素處理組689.7±10.5#158.7±17.8?#177.5±18.3?#NMDA+槲皮素+ANISO處理組650.2±10.3?&315.0±28.9?&309.5±32.3?&NMDA+槲皮素+P79350處理組654.1±10.7?&317.0±31.4?&307.4±29.8?&F值13.92146.21841.094P值0.0000.0000.000

注：與對照組比較，*P<0.05；與NMDA組比較，#P<0.05；與NMDA+槲皮素處理組比較，&P<0.05

3 討論

視神經(jīng)損傷是青光眼、糖尿病視網(wǎng)膜病變及年齡相關(guān)性黃斑變性等多種眼部疾病的共同結(jié)果[7]。槲皮素具有抗氧化作用，維持神經(jīng)元線粒體正常形態(tài)和功能，減少β-淀粉樣蛋白誘導(dǎo)的線粒體損傷[8]。槲皮素抑制大鼠青光眼模型以及體外培養(yǎng)RGC細(xì)胞凋亡、恢復(fù)線粒體功能并提高細(xì)胞存活率[9]。與之類似，本研究結(jié)果顯示，NMDA處理可誘導(dǎo)RGC-5細(xì)胞損傷，降低細(xì)胞活性，促進(jìn)LDH釋放，而槲皮素則能夠顯著減輕NMDA導(dǎo)致的細(xì)胞損傷。

氧化應(yīng)激是由ROS過量產(chǎn)生而抗氧化劑活性不足引起的，已被公認(rèn)為是神經(jīng)元損傷和死亡的關(guān)鍵因素[10]。MDA是脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物，可被用作氧化應(yīng)激引起的損傷的嚴(yán)重程度的度量[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，NMDA能顯著提高培養(yǎng)的RGC-5細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平，槲皮素預(yù)處理顯著降低了ROS和MDA的產(chǎn)生，并且提高抗氧化酶活性。宋海巖等[12]發(fā)現(xiàn)NMDA提高大鼠皮層神經(jīng)元NO濃度并促進(jìn)NOS表達(dá)，誘導(dǎo)興奮性神經(jīng)毒。本研究發(fā)現(xiàn)NMDA能顯著增強(qiáng)RGC-5細(xì)胞中iNOS和nNOS mRNA的表達(dá)，促進(jìn)NO的釋放，槲皮素預(yù)處理能加強(qiáng)NMDA的誘導(dǎo)作用。槲皮素對NOS的調(diào)控機(jī)制目前還沒有完全明確。有研究發(fā)現(xiàn)槲皮素通過抑制NF-κB活化，下調(diào)iNOS啟動子活化和基因表達(dá)[13]。相反，也有研究發(fā)現(xiàn)槲皮素對NOS的活性不產(chǎn)生影響[14]。這也說明槲皮素在不同類型的細(xì)胞中可能發(fā)揮不同的作用。

Bax的激活使細(xì)胞色素C從膜間隙釋放到細(xì)胞質(zhì)中，最終激活Caspase酶，開啟凋亡程序[15]?？沟蛲鱿嚓P(guān)蛋白Bcl-2抑制Bax活性并阻止細(xì)胞色素C的釋放。在本研究中，槲皮素預(yù)處理可降低NMDA誘導(dǎo)的Bax表達(dá)和Caspase-3活化，并促進(jìn)Bcl-2的表達(dá)。氧化應(yīng)激/ROS水平的增加可激活JNK/p38 MAPK信號[16]。研究發(fā)現(xiàn)槲皮素在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、心肌細(xì)胞、絨毛膜癌細(xì)胞中具有調(diào)節(jié)JNK/p38 MAPK信號活化的作用[15，17-18]。在本研究中，槲皮素預(yù)處理抑制NMDA誘導(dǎo)的JNK和p38 MAPK信號活化，應(yīng)用JNK激動劑ANISO或p38 MAPK激動劑P79350預(yù)處理均可顯著地抵消槲皮素的作用。這些結(jié)果提示槲皮素可能是通過調(diào)節(jié)JNK/p38 MAPK信號通路來拮抗NMDA誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷。

綜上所述，槲皮素呈劑量依賴性緩解氧化應(yīng)激條件下RGC-5細(xì)胞的損傷，其抗氧化作用機(jī)制可能與JNK/p38 MAPK信號通路的抑制有關(guān)。