楊嘯 范麗芬 姚艷玲 焦向英

基礎(chǔ)研究

GLP-1對(duì)高糖誘導(dǎo)乳鼠心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及機(jī)制分析

楊嘯 范麗芬 姚艷玲 焦向英

作者單位：030001 太原市，山西醫(yī)科大學(xué)生理教研室

目的 以高糖刺激的乳鼠心肌細(xì)胞模擬糖尿病誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷，給予胰高血糖樣多肽-1（GLP-1）預(yù)處理，觀察其對(duì)高糖引起的心肌細(xì)胞凋亡的影響，以及細(xì)胞內(nèi)硫氧還蛋白（Trx）系統(tǒng)的變化。方法 將分離培養(yǎng)48 h的大鼠乳鼠心肌細(xì)胞分為3組：①正常對(duì)照組：使用含葡萄糖5.5 mmol/L的DMEM培養(yǎng)基加入甘露醇20 mmol/L作為對(duì)照培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；②高糖組：使用含葡萄糖25 mmol/L的DMEM培養(yǎng)基作為高糖培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)模擬糖尿病；③高糖+GLP-1組：以含葡萄糖25 mmol/L的DMEM培養(yǎng)基加入終濃度10 nmol/L的GLP-1繼續(xù)培養(yǎng)模擬糖尿病GLP-1干預(yù)。心肌細(xì)胞分別在三種培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后測(cè)定指標(biāo)。結(jié)果 ①與正常組比較，高糖組細(xì)胞乳酸脫氫酶活性、細(xì)胞凋亡率、p38激酶活性均顯著升高，Trx活性明顯降低（P<0.05）；硫氧還蛋白表達(dá)無明顯變化，但細(xì)胞內(nèi)蛋白硝基化的標(biāo)志物3-硝基酪氨酸生成量增加，Trx的內(nèi)源性抑制蛋白硫氧還蛋白相互作用蛋白（TXNIP）表達(dá)明顯上調(diào)，活性氧（ROS）生成和丙二醛（MDA）的含量均明顯升高（P均<0.05）。②與高糖組比較，高糖+GLP-1組乳酸脫氫酶活性、細(xì)胞凋亡率、p38激酶活性明顯降低，Trx活性明顯恢復(fù)（P<0.05），3-硝基酪氨酸生成、TXNIP表達(dá)、活性氧生成和丙二醛的產(chǎn)生量均明顯降低（P均<0.05）。結(jié)論 高糖可引起培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞發(fā)生損傷和凋亡，這種損傷與高糖引起的Trx活性和功能下降有關(guān)。蛋白的硝基化、TXNIP的表達(dá)上調(diào)均可抑制Trx的活性，使其抗自由基和抗凋亡功能減弱，自由基生成增加，p38激酶介導(dǎo)的凋亡途徑加強(qiáng)，進(jìn)而引起心肌細(xì)胞損傷和凋亡。GLP-1處理可使高糖引起的TXNIP表達(dá)明顯下調(diào)，蛋白硝基化減輕，Trx活性得到改善，細(xì)胞自由基損傷和凋亡減輕，通過對(duì)Trx系統(tǒng)的保護(hù)而逆轉(zhuǎn)高糖引起的細(xì)胞損傷和凋亡。

硫氧還蛋白； 凋亡； 胰高血糖樣多肽-1； 心肌細(xì)胞

糖尿病的發(fā)病率增長迅速，已成為當(dāng)前威脅人類健康、縮短壽命的最重要疾病之一[1]。糖尿病作為一種慢性疾病，長期的代謝紊亂可引起多個(gè)器官發(fā)生病變，其中以心臟并發(fā)癥的危害最嚴(yán)重，已成為糖尿病患者死亡的主要危險(xiǎn)因素，高達(dá)糖尿病患者死亡原因的55%[2]。在心臟，長期的慢性損傷主要引起細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者心肌細(xì)胞凋亡發(fā)生率為非糖尿病患者的85倍[3]。

近年來，胰高血糖素樣肽－1（GLP-1）在糖尿病的發(fā)生、發(fā)展及治療領(lǐng)域方面的作用備受關(guān)注，尤其是對(duì)胰島B細(xì)胞凋亡的抑制作用方面。而我們知道GLP-1受體（GLP-1R）分布廣泛，除胰腺β細(xì)胞外，還分布于大腦、肺、心臟、腎臟等，其分布的廣泛性也決定其作用的廣泛性。研究發(fā)現(xiàn)，GLP-1在這些組織中發(fā)揮作用與其對(duì)細(xì)胞凋亡的影響密不可分。

在諸多可能誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡的因素中，考慮到大量自由基生成在糖尿病發(fā)病機(jī)制中的核心作用，我們選擇了硫氧還蛋白（thioredoxin，Trx）系統(tǒng)這種既有強(qiáng)大抗自由基損傷功能，又有重要促生長和凋亡抑制功能的蛋白系統(tǒng)作為探討GLP-1抗心肌細(xì)胞凋亡的靶點(diǎn)。而TXNIP是目前發(fā)現(xiàn)的唯一一種內(nèi)源性的Trx結(jié)合抑制蛋白[4]。TXNIP可與Trx結(jié)合，結(jié)合的Trx失去凋亡抑制功能而使凋亡增加[5]。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 主要儀器和試劑 DMEM培養(yǎng)基購于Hy－Clone公司；胎牛血清購于杭州四季青生物工程有限公司；GLP-1、胰蛋白酶、Ⅱ型膠原酶、5-溴脫氧尿嘧啶核苷（BrdU）、胰島素（Insulin）、NADPH、Tris-HCL、DTNB、 鹽酸胍 （Guanidine hydrochloride）、Thioredoxin Reductase、β-actin 抗 體（Monoclonal Anti-β-actin）、PVDF 膜等均購于 Sigma公司；BCA試劑盒購于Pierce；Trx抗體（Rabbit anti-thioredoxin polyclonal antibody）購于 Millipore公司；辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；3-硝基酪氨酸（3-NT）測(cè)定試劑盒購于上海西唐生物科技有限公司；乳酸脫氫酶測(cè)定試劑盒購于南京建成生物集團(tuán)有限公司；活性氧（ROS）測(cè)定試劑盒購于普利萊基因技術(shù)有限公司；丙二醛（MDA）測(cè)定試劑盒購于碧云天生物科技有限公司。

1.1.2 主要儀器 BJ-1CD單人單面垂直凈化工作臺(tái)購于上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；IX51倒置熒光顯微鏡購于日本OLYMPUS公司；Heracell 150i CO2培養(yǎng)箱購于美國Thermo Electron公司；Mx3005P Real-Time PCR儀（美國STRATAGENE公司）；酶標(biāo)儀（美國Molecular Devices公司）；電泳儀和半干轉(zhuǎn)印（美國BIO-RAD公司）；Kodak Image Station 400（美國 Kodak公司）；FACS Calibur流式細(xì)胞儀（美國B-D公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 1～3 d齡健康SD乳鼠（山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 將分離培養(yǎng)48 h的大鼠乳鼠心肌細(xì)胞隨機(jī)分為3組：①正常對(duì)照組：使用含葡萄糖5.5 mmol/L的DMEM培養(yǎng)基，加甘露醇20 mmol/L作為對(duì)照培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；②高糖組：使用含葡萄糖25 mmol/L的DMEM培養(yǎng)基作為高糖培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；③高糖+GLP-1組：使用含葡萄糖25 mmol/L的DMEM培養(yǎng)基加入終濃度10 nmol/L的GLP-1進(jìn)行培養(yǎng)。三組細(xì)胞均繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集上清液和細(xì)胞裂解液待測(cè)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 培養(yǎng)基乳酸脫氫酶（LDH）活性測(cè)定 細(xì)胞損傷發(fā)生后，細(xì)胞內(nèi)的LDH漏出到細(xì)胞外，因此可以通過測(cè)定培養(yǎng)基上清中LDH活性反映心肌細(xì)胞損傷的程度。本實(shí)驗(yàn)使用南京建成生物工程研究所乳酸脫氫酶測(cè)定試劑盒進(jìn)行測(cè)定。LDH能催化乳酸生成丙酮酸，丙酮酸與2，4-二硝基苯肼反應(yīng)生成丙酮酸二硝基苯腙，在堿性溶液中呈棕紅色，在440 nm處有最大吸收峰，通過吸光度值可得出酶活力。收集各組細(xì)胞培養(yǎng)基上清0.5 ml，按乳酸脫氫酶測(cè)定試劑盒說明書操作，并計(jì)算乳酸脫氫酶活性。

1.3.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)心室肌細(xì)胞凋亡 以標(biāo)記了FITC的Annexin V作為熒光探針，利用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡可檢測(cè)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，以Propidium Iodide（PI）來區(qū)分存活的早期細(xì)胞和壞死或晚期凋亡細(xì)胞。給藥處理的心肌細(xì)胞培養(yǎng)24 h后用0.25%的胰酶消化，然后加入含10%FBS的DMEM液終止消化。洗滌后加150 μl緩沖液重懸細(xì)胞，細(xì)胞懸液加入10 μl Annexin V-FITC輕輕混勻，室溫避光孵育15 min，加入5 μl PI及150 μl緩沖液立即上機(jī)檢測(cè)。

1.3.3 p38活性分析 按試劑盒中提供的試劑和方法，采用免疫沉淀（immunoprecipitation，IP）的方法，將定量后的200 μl細(xì)胞裂解物和20 μl磷酸化的p38一抗4℃孵育過夜，次日將混合物14 000 g離心 1 min，隨后用 1×lysis buffer和 1×Kinase buffer各洗 2 遍，然后和 50 μl 1×Kinase buffer、kinase substrate、ATP（10 mmol/L）30 ℃孵育 30 min，4×SDS上樣緩沖液終止反應(yīng)，95℃煮樣5 min。用Western immunoblot方法檢測(cè)ATF的表達(dá)量，方法和條件同前面的Western blot。

1.3.4 成年大鼠心肌細(xì)胞硫氧還蛋白（Trx）活性的測(cè)定 用胰島素還原法檢測(cè)成年大鼠心肌細(xì)胞Trx活性，即將心肌細(xì)胞裂解液（以Cell signaling公司的cell lysis buffer常規(guī)提取細(xì)胞蛋白，并測(cè)定蛋白濃度）與胰島素、TR和NADPH孵育。酶標(biāo)儀檢測(cè)412 nm處的OD值，計(jì)算出Trx的活性。

1.3.5 3-硝基酪氨酸含量測(cè)定 使用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測(cè)定。用抗大鼠3-NT單抗包被于酶標(biāo)板上，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品中的3-NT與單抗結(jié)合，加入生物素化的抗大鼠3-NT，形成免疫復(fù)合物連接在板上，辣根過氧化物酶標(biāo)記的Streptavidin與生物素結(jié)合，加入底物工作液顯藍(lán)色，最后加終止液硫酸，在450 nm處測(cè)OD值，3-NT濃度與OD值呈正比，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出標(biāo)本中3-NT濃度。

1.3.6 Real-time PCR方法測(cè)定培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞TXNIP的mRNA表達(dá) 心肌細(xì)胞RNA提取使用RNAiso Plus，cDNA合成使用PrimeScriptTM RT reagent Kit。條件：37 ℃，15 min；85 ℃，5 s；4 ℃保存。Real time PCR檢測(cè)儀器為Mx3005P real time PCR儀。反應(yīng)條件為：預(yù)變性95℃30 s；PCR反應(yīng)95℃5 s，60℃ 20 s，45個(gè)循環(huán)。熔解曲線設(shè)置 95℃1 min，55 ℃ 30 s，95 ℃ 30 s。選用 GAPDH（引物由Invitrogen 公司合成）作為參照，結(jié)果采用 2-ΔΔCt法進(jìn)行相對(duì)定量分析。使用的相關(guān)基因引物序列如下：

GAPDH 引物序列（GeneID：24383）

上游引物：5’-2ATGGTGAAGGTCGGTGTG2-3’

下游引物：5’-2AACTTGCCGTGGGTAGAG2-3’

TXNIP引物序列（GeneID：117514）

上游引物：5’-GGCAATCAGTAGGCAAGTCTCCA-3’

下游引物：5’-TTCCGACATTCACCCAGCAA-3’

1.3.7 Western blot方法測(cè)定培養(yǎng)48 h后乳鼠心肌細(xì)胞Trx1、TXNIP的蛋白表達(dá) 將培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng)基吸出，1×PBS清洗2遍，每皿內(nèi)加入裂解液50 μl，吸入1.5 ml EP管內(nèi)，超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)裂解細(xì)胞，并以10 000 rpm、4℃離心10 min，取上清液。BCA法進(jìn)行蛋白定量，取等量蛋白（60 μg）進(jìn)行SDSPAGE電泳分離（BIO-RAD）。先在恒壓80 V電泳約20 min，隨后120 V電泳90 min；然后在25 V的條件下轉(zhuǎn)膜40 min，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜（BIORAD）上；5%BSA室溫封閉2 h，分別加入相應(yīng)的一抗（TXNIP 稀釋度 1∶1250，Trx稀釋度為 1∶2500；β-actin的稀釋度為 1∶1000），4 ℃過夜；次日用 1×洗膜緩沖液洗4次，每次5 min。加入用TBST稀釋HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗（1∶3000），將膜置于其中室溫輕搖1 h，同樣的方法洗膜20 min。加入DAB顯色液（Vector），室溫下孵育 3 min，用 Kadak成像掃描儀內(nèi)掃描拍攝蛋白條帶。以β-actin為內(nèi)參照，實(shí)驗(yàn)在相同的條件下至少重復(fù)6次。利用Alpha View Version 3.4.0.0圖像分析軟件進(jìn)行條帶分析。

1.3.8 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧生成 去除細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS洗2次，加入1 ml按照1∶1000用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA。繼續(xù)在CO2培養(yǎng)箱37℃孵育細(xì)胞1 h，用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，用0.25%胰酶消化收集各組細(xì)胞，洗滌后加150 μl緩沖液重懸細(xì)胞用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.9 培養(yǎng)48 h后乳鼠心肌細(xì)胞脂質(zhì)過氧化水平——丙二醛含量檢測(cè)丙二醛（Malondialdehyde，MDA）是生物體脂質(zhì)氧化的天然產(chǎn)物。細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激（oxidative stress）時(shí)，會(huì)發(fā)生脂質(zhì)氧化。一些脂肪酸氧化后逐漸分解為一系列復(fù)雜的化合物，其中包括MDA，此時(shí)通過檢測(cè)MDA水平即可檢測(cè)脂質(zhì)氧化的水平。丙二醛在較高溫度及酸性環(huán)境中可與TBA發(fā)生反應(yīng)，形成紅色的MDA-TBA加合物，MDA-TBA加合物在535 nm處有最大吸收，用酶標(biāo)儀讀出535 nm的OD值，然后根據(jù)試劑盒中的標(biāo)準(zhǔn)品計(jì)算出發(fā)生脂質(zhì)氧化細(xì)胞的比例。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以±s表示，樣本例數(shù)n代表所測(cè)樣品來源的乳鼠例數(shù)，組間比較使用t檢驗(yàn)。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乳鼠心肌細(xì)胞接種后48 h的形態(tài)觀察 接種48 h后細(xì)胞形成細(xì)胞簇或細(xì)胞單層，貼壁細(xì)胞呈梭形、多角形，通過周邊突起的偽足相互交聯(lián)，鋪滿瓶底，呈放射狀排列的同心圓狀或峰谷樣生長，細(xì)胞搏動(dòng)逐漸同步，收縮有力，于72 h達(dá)高峰。

2.2 乳酸脫氫酶（LDH）活性測(cè)定 經(jīng)檢測(cè)，與正常對(duì)照組心肌細(xì)胞相比，高糖組乳鼠心肌細(xì)胞的乳酸脫氫酶活性增高［（1.685±0.130）比（1.000±0.130），P<0.05］，提示高糖可引起心肌細(xì)胞損傷；而GLP-1組乳酸脫氫酶活性下降［（0.725±0.200）比（1.685±0.130），P<0.05］，表明 GLP-1處理能明顯減輕高糖對(duì)細(xì)胞的損傷。見圖1。

圖1 高糖刺激和GLP-1預(yù)處理對(duì)乳鼠心肌細(xì)胞乳酸脫氫酶活性的影響

2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)心室肌細(xì)胞凋亡 結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組心肌細(xì)胞相比，高糖組乳鼠心肌細(xì)胞凋亡明顯增加 ［（16.60±2.35）%比 （9.99±1.97）%，P<0.05］，同時(shí)給予GLP-1預(yù)處理后凋亡減少［（10.06±1.48）%比（16.60±2.35）%，P<0.05］，表明GLP-1對(duì)高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用。見圖2。

2.4 P38活性分析 結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組心肌細(xì)胞相比，高糖組乳鼠心肌細(xì)胞P38激酶活性增高［（1.456 ±0.080）比（1．000 ±0.163），P<0.05］，給 予GLP-1 處理后降低［（0.782±0.094）比（1.456±0.080），P<0.05］。見圖 3。

圖2 高糖刺激和GLP-1預(yù)處理對(duì)乳鼠心肌細(xì)胞凋亡率影響

圖3 高糖刺激和GLP-1預(yù)處理對(duì)乳鼠心肌細(xì)胞P38活性影響

2.5 TRX活性分析 經(jīng)檢測(cè)，與正常對(duì)照組心肌細(xì)胞相比，高糖組乳鼠心肌細(xì)胞TRX活性顯著降低 ［（0.33±0.02） 比 （1．00±0.11），P<0.05］，給予GLP-1處理后高糖引起的TRX活性降低得以改善［（1.15±0.07）比（0.33±0.02），P<0.05］。見圖 4。

2.6 3-硝基酪氨酸含量測(cè)定 經(jīng)檢測(cè)，與正常對(duì)照組心肌細(xì)胞相比，高糖組心肌細(xì)胞內(nèi)3-NT含量較高［（16.978±0.200）μg/ml比（7.876±1.574）μg/ml，P<0.05］，給予 GLP-1處理后 3-NT含量降低［（9.550±0.500）μg/ml比（16.978±0.200）μg/ml，P<0.05］。見圖 5。

圖4 高糖刺激和GLP-1預(yù)處理對(duì)乳鼠心肌細(xì)胞Trx活性影響

圖5 高糖刺激和GLP-1預(yù)處理對(duì)乳鼠心肌細(xì)胞3-硝基酪氨酸含量

2.7 硫氧還蛋白表達(dá) 結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組心肌細(xì)胞相比，高糖組乳鼠心肌細(xì)胞Trx1蛋白表達(dá)未見明顯變化［（1.001±0.018）比（1.000±0.023），P>0.1］。見圖 6。

圖6 高糖刺激和GLP-1預(yù)處理對(duì)乳鼠心肌細(xì)胞Trx相對(duì)表達(dá)量的影響

2.8 TXNIP表達(dá)

2.8.1 蛋白水平 經(jīng)檢測(cè)，與正常對(duì)照組心肌細(xì)胞相比，高糖組乳鼠心肌細(xì)胞TXNIP表達(dá)明顯增高［（1.48±0.08）比（1.00±0.05），P<0.05］，給予 GLP-1處理逆轉(zhuǎn)了由高糖引起的TXNIP表達(dá)的改變［（0.97±0.03）比（1.48±0.08），P<0.05］。見圖 7。

圖7 高糖刺激和GLP-1預(yù)處理對(duì)乳鼠心肌細(xì)胞TXNIP表達(dá)量的影響

2.8.2 mRNA水平 經(jīng)檢測(cè)，與正常對(duì)照組心肌細(xì)胞相比，高糖組乳鼠心肌細(xì)胞在培養(yǎng)48 h后，TXNIP mRNA 水平顯著增加［（12.873±1.726）比（1.000±0.000），P<0.05］， 給 予 GLP-1 處 理 后TXNIP mRNA 水平明顯降低 ［（9.950±2.250）比（12.873±1.726），P<0.05］。見圖 8。該結(jié)果提示，給予GLP-1處理能有效逆轉(zhuǎn)由高糖引起的心肌細(xì)胞TXNIP mRNA水平的增加。

圖8 高糖刺激和GLP-1預(yù)處理對(duì)乳鼠心肌細(xì)胞TXNIPmRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

2.9 活性氧（ROS）生成測(cè)定 經(jīng)檢測(cè)，與正常對(duì)照組心肌細(xì)胞相比，高糖組乳鼠心肌細(xì)胞在培養(yǎng)48 h后，細(xì)胞內(nèi)活性氧生成顯著增加［（1.70±0.07）比（1.00±0.11），P<0.05］，給予 GLP-1 處理后活性氧生成量降低［（0.69±0.09）比（1.70±0.07），P<0.05］。見圖9。該結(jié)果提示，給予GLP-1處理能有效減少由高糖引起的心肌細(xì)胞內(nèi)活性氧生成。

2.10 丙二醛（MDA）測(cè)定 經(jīng)檢測(cè)，與正常對(duì)照組心肌細(xì)胞相比，高糖組心肌細(xì)胞在培養(yǎng)48 h后，細(xì)胞內(nèi) MDA 水平顯著增加［（11.043±0.730）μmol/mg比（5.506±0.360）μmol/mg，P<0.05］，給予 GLP-1 處理后 MDA 水平明顯降低［（4.958±0.370）μmol/mg比（11.043±0.730）μmol/mg，P<0.05］（圖 10）。該結(jié)果提示，給予GLP-1處理能有效減輕高糖誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化損傷。

圖9 高糖刺激和GLP-1預(yù)處理對(duì)乳鼠心肌細(xì)胞內(nèi)活性氧生成的影響

圖10 高糖刺激和GLP-1預(yù)處理對(duì)乳鼠心肌細(xì)胞內(nèi)MDA含量的影響

3 討論

本研究結(jié)果顯示，高糖可顯著誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡、活性氧生成及細(xì)胞脂質(zhì)過氧化，其中伴隨TRX系統(tǒng)的改變。此外，本研究證實(shí)GLP-1具有減輕心肌細(xì)胞凋亡、清除活性氧、減輕細(xì)胞脂質(zhì)過氧化，從而對(duì)高糖誘導(dǎo)的乳鼠心肌細(xì)胞損傷起到保護(hù)作用。GLP-1的這種保護(hù)作用伴隨著TRX系統(tǒng)的改變，尤其是Trx活性增加以及上調(diào)的TXNIP表達(dá)受到抑制。

臨床上糖尿病的心血管并發(fā)癥發(fā)病率非常高。究其原因，目前普遍接受的觀點(diǎn)之一是：長期高糖刺激所致的氧化應(yīng)激損傷心肌功能[6，7]。心肌細(xì)胞中存在著氧化和抗氧化兩大系統(tǒng)的平衡，一旦這一平衡被打破即可誘發(fā)氧化應(yīng)激損傷。高糖引起氧化系統(tǒng)功能增強(qiáng)、活性氧生成增強(qiáng)、氧化應(yīng)激產(chǎn)物增多，如膜脂質(zhì)氧化產(chǎn)物丙二醛和蛋白質(zhì)硝基化物三硝基酪氨酸生成升高。大量自由基可以導(dǎo)致線粒體功能異常，線粒體細(xì)胞色素C釋放，最終啟動(dòng)Caspase-9介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑[8]。此外，自由基還可引起很多功能蛋白質(zhì)硝基化修飾而影響其功能。考慮到糖尿病發(fā)生發(fā)展中大量的自由基產(chǎn)生極其關(guān)鍵性作用，我們選擇Trx系統(tǒng)這個(gè)在許多自由基損傷及凋亡參與的疾病過程如腫瘤、炎癥、再灌注損傷中發(fā)揮重要作用的系統(tǒng)作為靶點(diǎn)。Trx是細(xì)胞內(nèi)重要的抗氧化物質(zhì)，它通過與氧自由基反應(yīng)，減少氧化型蛋白生成而發(fā)揮重要的抗氧化作用，同樣發(fā)揮著重要的抗凋亡作用通過結(jié)合并抑制凋亡調(diào)節(jié)激酶-1（ASK1）活性[9]。在本研究中我們觀察到，高糖組心肌細(xì)胞3-NT生成量增加，提示Trx硝基化可能是其活性受抑制的原因之一。TXNIP是目前發(fā)現(xiàn)的唯一一種內(nèi)源性的Trx結(jié)合抑制蛋白[4]，在腫瘤[10]、糖尿病等疾病中發(fā)揮作用，TXNIP引起心肌細(xì)胞損傷的機(jī)制可能主要與其對(duì)Trx的結(jié)合和功能抑制有關(guān)[11]。本實(shí)驗(yàn)中我們考慮TXNIP表達(dá)上調(diào)抑制Trx活性是其活性降低的另一個(gè)重要原因。

胰高血糖素樣肽1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）又稱腸促胰島素，在體內(nèi)葡萄糖穩(wěn)態(tài)過程中發(fā)揮重要作用。GLP-1可以通過促進(jìn)胰島素分泌[12]、減低胰島α細(xì)胞分泌胰高血糖素、回復(fù)胰島B細(xì)胞功能、改善胰島素第一時(shí)相的缺陷[13]等途徑來控制血糖，另外還可以減輕體重[14]。這些優(yōu)勢(shì)使其有望成為治療2型糖尿病及其相關(guān)心腦血管并發(fā)癥的新型藥物。GLP-1是通過結(jié)合胰島等組織細(xì)胞上存在的特異性受體GLP-1受體，并影響介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)通路而發(fā)揮其相應(yīng)功能的。GLP-1受體屬于與G蛋白耦聯(lián)的7次跨膜胰島素受體家族成員。隨著GLP-1受體在心血管系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)，GLP-1對(duì)心血管作用及其機(jī)制的研究成了當(dāng)前關(guān)注的焦點(diǎn)。但是GLP-1確切機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

在本研究中，從測(cè)得的LDH活性和凋亡率我們可以看出，GLP-1成功逆轉(zhuǎn)了高糖對(duì)培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞的損傷作用。GLP-1使高糖誘導(dǎo)自由基生成和MDA產(chǎn)生均明顯下降。GLP-1對(duì)Trx系統(tǒng)的影響首次得到觀察。我們的研究證實(shí)，GLP-1預(yù)處理能使高糖損傷的Trx的活性和功能得到恢復(fù)。在本實(shí)驗(yàn)中，GLP-1減少高糖誘導(dǎo)的氧化亞硝基產(chǎn)生、Trx硝基化和TXNIP表達(dá)上調(diào)，充分顯示了其對(duì)Trx功能的保護(hù)作用。

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The mechanism of GLP-1 protection against high glucose induced neonatal cardiomyocytes injury

YANG Xiao， FAN Li-Fen， YAO Yan-Ling， et al.Department of Physiology， Shanxi Medical University， Taiyuan 030001，China

Objective This study was designed to identify whether GLP-1 can relieve the apoptosis of neonatal rat cardiomyocyte induced by glucose toxicity，the mechanisms responsible for the effect of GLP-1 were also analyzed.Methods Cardiomyocytes cultured in 48 hours were then randomly divided into 3 groups：normal glucose group，high glucose group and high glucose+GLP-1 group.For normal glucose group，cardiomyocytes were cultured in DMEM containing 5.5 mmol/L glucose and 20 mmol/L mannitol served as a normal control.For the two high glucose groups， cardiomyocytes were cultured in high glucose DMEM containing 25 mmol/L glucose.Cardiomyocytes in high glucose+GLP-1 group were pretreated with GLP-1（10 nmol/L final concentration） for and then high glucose DMEM.After additional 24 hours culture，cells and medium were collected for further assays.Results ⑴Compared with control group，high glucose group showed increased activity of LDH，apoptosis rate，p38 kinase activity， quantitation of cellular 3-Nitrotyrosine content， TXNIP expression， reactive oxygen speciesgeneration，malondialdehyde（MDA） contents in cardiomyocytes and depressed activity of TRX.⑵Compared with High glucose group，high glucose and GLP-1 group showed depressed activity of LDH，apoptosis rate，p38 kinase activity， quantitation of cellular 3-Nitrotyrosine content， TXNIP expression， reactive oxygen species generation，malondialdehyde（ MDA） contents in cardiomyocytes and increased activity of TRX.Conclusion High glucose induces increased cell damage and cell apoptosis， with the generation of free radical， lipid peroxidation damage and TRX system change， the decrease of TRX activity， and down regulate of TXNIP expression.Treatment with GLP-1 relieves recovered Trx activity， decreases intracellular reactive oxygen species generation， MDA content， 3-nitrotyrosine production and TXNIP expression are decrease markedly.GLP-1 successfully relieves high glucose induced cell injury and apoptosis.

Thioredoxin； Apoptosis； GLP-1； Cardiomyocyte

國家自然科學(xué)基金（項(xiàng)目編號(hào)：30800399）；山西省留學(xué)人員科技活動(dòng)擇優(yōu)資助項(xiàng)目［項(xiàng)目編號(hào)：2010（97）］；山西省留學(xué)歸國人員科研資助項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：2009-46）；山西省高等學(xué)校創(chuàng)新人才支持計(jì)劃

10．3969/j．issn．1672－5301．2014．05．015

Q95-33；R542.2

A

1672-5301（2014）05-0442－07

2014-01-26）