高亞男 趙雷 盧志耀 封啟龍 吳博威

基礎研究

KB-R7943對心力衰竭家兔哇巴因誘發(fā)心律失常的抑制作用

高亞男 趙雷 盧志耀 封啟龍 吳博威

作者單位：030001 太原市，山西醫(yī)科大學生理學系，細胞生理學省部共建教育部重點實驗室（高亞男、封啟龍、吳博威），基礎醫(yī)學院（盧志耀）；武漢大學基礎醫(yī)學院（趙雷）

目的 探討鈉-鈣交換體抑制劑KB-R7943對哇巴因誘發(fā)心衰家兔心律失常的影響。方法40只成年家兔隨機分為5組：假手術組、心衰對照組、哇巴因組、哇巴因合并KB-R7943（1 μmol/L）組和哇巴因合并 KB-R7943（ 5 μmol/L）組。 心衰組、哇巴因組、哇巴因合并 KB-R7943（ 1 μmol/L）組和哇巴因合并 KBR7943（5 μmol/L）組使用主動脈瓣關閉不全聯(lián)合腹主動脈縮窄的方法建立心衰模型。建模8周后超聲檢測心功能，并利用Langendorff離體心臟灌流方法檢測家兔各項離體心功能指標。灌流哇巴因（5 μmol/L，4 ml）誘發(fā)家兔心衰心臟產生心律失常，觀察KB-R7943對離體心衰家兔心律失常的影響。結果 ①超聲結果顯示，與假手術組相比，心衰對照組家兔左室射血分數（LVEF）、短軸縮短率（%FS）均明顯降低（P<0.05）。②離體條件下，心衰對照組家兔離體心臟左室發(fā)展壓（LVDP）、心率（HR）、室內壓最大上升速率（＋dp/dtmax）、室內壓最大下降速率（－dp/dtmax）較假手術組均明顯下降（P<0.05）。③哇巴因組1 h內總心律失常（TT）、室速（VT）、室顫（VF）持續(xù)時間較心衰對照組明顯增加（P<0.05）。④與哇巴因組比較，哇巴因聯(lián)合應用KB-R7943組 1 h 內 TT、VT 、VF 持續(xù)時間明顯減短（ P<0.05）；與 1 μmol/L KB-R7943 相比，5 μmol/L KB-R7943 可使哇巴因誘發(fā)TT和VT時間進一步縮短（P<0.05）。結論 鈉-鈣交換體抑制劑KB-R7943可抑制哇巴因誘發(fā)心衰家兔心律失常的持續(xù)時間，且較高濃度（5 μmol/L）KB-R7943對哇巴因誘發(fā)心衰家兔心律失常的抑制作用更強。

鈉-鈣交換體； KB-R7943； 心力衰竭； 心律失常； 哇巴因

充血性心力衰竭簡稱心衰，指由于心室泵血或充盈功能低下，心排血量不能滿足機體代謝需要的一類綜合征，是多種心血管疾病終末期的表現(xiàn)，是21世紀心血管醫(yī)生面臨的兩大挑戰(zhàn)之一[1]。隨著年齡增長，心力衰竭的患病率顯著提高，已成為65歲以上患者住院的重要原因。洋地黃類藥物是臨床治療心衰的常用藥物，但是因其安全范圍很小，用量掌握不當很容易導致藥物中毒而誘發(fā)心律失常。許多研究表明，洋地黃中毒所致的心律失常與心肌細胞內鈣超載密切相關。在心力衰竭時，反向模式的鈉-鈣交換體（NCX）的激活所介導的鈣內流是心肌細胞鈣超載的重要機制[2]。有文獻報道[3，4]，心肌NCX與心肌缺血-再灌注損傷期間發(fā)生的鈣超載及心律失常有關，抑制NCX可減輕缺血再灌注損傷及其誘發(fā)的心律失常。然而，抑制NCX能否減輕洋地黃類藥物所致心力衰竭心臟發(fā)生的心律失常，迄今鮮有報道。本研究在建立家兔心衰模型的基礎上，利用離體心臟灌流系統(tǒng)觀察NCX特異性阻斷劑KB-R7943對洋地黃藥物哇巴因誘發(fā)心衰家兔心律失常的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 成年家兔，體重（2.5±0.1）kg，雌雄不限（山西醫(yī)科大學實驗動物中心提供）。動物隨機分為5組：假手術組、心衰對照組、哇巴因組、哇巴因合并KB-R7943（1 μmol/L）組和哇巴因合并KB-R7943（5 μmol/L）組，每組 8 只。

1.2 藥品與試劑 KB-R7943、哇巴因（美國SIGMA公司），NaCl、NaH2PO4、MgCl2、CaCl2和KCl（BIO BASIC INC公司），其余試劑均為國產分析純產品。

1.3 實驗儀器 Vivid7 Rro超聲檢測儀（美國GE公司）、RM6240B生物信號采集處理系統(tǒng)2.0e和YPJ01型壓力換能器（成都醫(yī)療儀器廠）、HX200一動物呼吸機（成都泰盟科技有限公司）、Langendorff離體心臟灌流裝置（ADInstruments公司）、BQ50lJ蠕動泵（保定蘭格恒流泵有限公司）、85-2恒溫磁力攪拌器、pH計（上海精科公司）、電子天平（德國Sartorius BSA124S）。

1.4 主要溶液配制 臺氏液（mmol/L）：NaH2PO40.33、glucose 10、MgCl21.0、HEPES 5.0、NaCl 140、CaCl21.8、KCl 5.4，用NaOH調節(jié)pH至7.38。哇巴因溶液（5 μmol/L）：生理鹽水 100 ml、哇巴因（364 μg）。KB-R7943 溶液（500 μmol/L）：生理鹽水 10 ml、KB-R7943（4.27 mg）。

1.5 心衰模型的制備[5]使用主動脈瓣關閉不全型合并腹主動脈縮窄方法建立心力衰竭模型。家兔稱重，3%的戊巴比妥鈉30 mg/kg劑量麻醉，無菌條件下手術。暴露出右側頸動脈，將連接壓力換能器充滿肝素的4 F導管由右側頸總動脈切口插入左心室，用力快速捅穿瓣膜數次，當脈壓增加幅度＞50%時，表明主動脈瓣已有破損。2周后進行腹主動脈縮窄手術。將直徑2.42 mm的導管與腹主動脈平行放置，一起結扎后緩慢撤出導管，使腹主動脈直徑縮小一半。術后均注射青霉素3 d以防感染。

1.6 超聲心動圖檢測 用小動物專用超聲探頭，于造模后8周進行檢測。超聲測量以下指標：室間隔舒張期厚度（IVSd）、室間隔收縮期厚度（IVSs）、左室壁舒張期厚度（LVIDd）、左室壁收縮期厚度（LVIDs）、左室后壁舒張期厚度（LVPWd）、左室后壁收縮期厚度（LVPWs）、左室射血分數（LVEF）和短軸縮短率（FS）。

1.7 離體心臟灌流方法 家兔稱重，3%的戊巴比妥鈉溶液麻醉，腹腔注射肝素鈉1000 IU。開胸迅速取出心臟（主動脈預留1.5 cm用以插管）置于4℃臺式液中，修剪后懸掛于Langendorff灌流裝置上，以100%氧氣飽和臺式液恒溫（37℃）、恒壓（7.35 kPa）灌流心臟。在左心耳下緣剪0.5 cm的切口，將連接壓力換能器的乳膠囊泡經切口插入左心室，舒張壓調整在 0～10 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）范圍內。灌流心臟30 min，各指標穩(wěn)定后進行實驗，觀測假手術組和心衰組LVDP、HR、±dp/dtmax。將心電圖正負極導線分別貼附于心臟右心耳下緣和心尖處，記錄心電圖。心衰組用正常臺式液灌流以作對照，哇巴因組灌流含5 μmol/L哇巴因的臺式液，哇巴因合并KB-R7943組在灌流含5 μmol/L哇巴因的臺式液前預先加灌 KB-R7943（1 μmol/L、5 μmol/L），記錄1 h內各組心律失常的持續(xù)時間。

1.8 統(tǒng)計學方法 實驗數據采用SPSS 13.0統(tǒng)計分析軟件進行處理。結果以±s表示，組間均數比較用單因素方差分析（ANOVA）。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 實驗動物心臟超聲檢查 與假手術組相比，心衰對照組家兔心臟 IVSd為（3.2±0.4）mm、IVSs（3.7±0.5）mm、LVIDd（21.8±2.1）mm、LVIDs（13.0±2.5）mm、LVPWd（3.5 ±0.4）mm、LVPWs（4.2 ±0.4）mm，均明顯增加（P<0.05）；EF（8.5±9.7）%、FS（23.0±5.3）%，明顯降低（P<0.05）。超聲結果顯示心力衰竭模型制備成功。見表1，圖1。

2.2 家兔離體心臟心功能檢測結果 與假手術組相比，心衰組家兔離體心臟LVDP為（32.6±8.4）mm Hg、HR（70.7±15.4）次/min、＋dp/dtmax（353.0±30.9）mm Hg/s、－dp/dtmax（276.1±38.6）mm Hg/s，均明顯降低（P<0.05），提示心衰兔心室舒張和收縮功能均下降。見表2。

2.3 各組心律失常持續(xù)時間比較 心衰組離體心臟給予哇巴因（5 μmol/L、4 ml）后，在 1 h 內總心律失常（TT）時間為（1427.3±77.3）s、室速（VT）時間（254.3±17.8）s、室顫（VF）時間（18.60±7.10）s，與心衰對照組相比均明顯增加（P<0.05）。哇巴因聯(lián)合應用 KB-R7943（1 μmol/L） 組總心律失常時間（766.1±10.3）s、室速時間（167.2±11.9）s、室顫時間（6.80±2.90）s，與單獨使用哇巴因組相比均明顯縮短（P<0.05）。此外，與 1 μmol/L KB-R7943 組相比，5 μmol/L KB-R7943可使哇巴因誘發(fā)總心律失常、室速的持續(xù)時間進一步縮短，分別為（343.0±18.9）s和（44.1±18.5）s（P<0.05）。見表 3，圖 3。

表1 假手術組、心衰組家兔心臟超聲檢測結果（±s）

表1 假手術組、心衰組家兔心臟超聲檢測結果（±s）

注：與假手術組相比，aP<0.05

FS（%）假手術組 8 2.5±0.2 2.9±0.2 14.9±4.1 8.0±2.4 2.5±0.3 3.1±0.4 71.5±9.5 41.0±6.2心衰組 8 3.2±0.4a3.7±0.5a21.8±2.1a13.0±2.5a3.5±0.4a4.2±0.4a48.5±9.7a23.0±5.3a組別 例數 IVSd（mm）IVSs（mm）LVIDd（mm）LVIDs（mm）LVPWd（mm）LVPWs（mm）EF（%）

表2 各組家兔離體心臟心功能檢測結果（±s）

表2 各組家兔離體心臟心功能檢測結果（±s）

注：與假手術組相比，aP<0.05

-dp/dtmax（mm Hg/s）假手術組 8 80.9±9.9 168.1±13.7 1234.3±156.6 880.0±84.0心衰組 8 32.6±8.4a70.7±15.4a353.0±30.9a276.1±38.6a組別 例數 LVDP（mm Hg）HR（次/min）+dp/dtmax（mm Hg/s）

3 討論

圖1 假手術與心衰模型兔超聲心動圖

Na+/Ca2+交換體（NCX）是一種重要的雙向跨膜轉運蛋白，具有正向（鈣外排）和反向（鈣內流）兩種轉運模式[6]。NCX具有生電性，正向模式將3個Na+運入細胞伴隨著1個Ca2+排出細胞，產生內向電流。當細胞內鈣超載時，肌漿網釋放鈣離子增加,使細胞內鈣離子濃度急劇增加[7]。由于細胞內外鈣離子濃度的變化,大量激活正向型NCX，由此產生的瞬時內向電流可導致遲后除極（DADS）和觸發(fā)性心律失常。在心肌細胞中，NCX對胞內鈣離子的調控起著很重要的作用。生理狀態(tài)下NCX活動是心肌細胞鈣外排的主要機制之一，以使胞內Ca2+恢復至靜息水平。在病理狀態(tài)下，如缺血/再灌注、心力衰竭，通過反向NCX進入細胞內鈣離子可觸發(fā)肌漿網釋放鈣離子，引起細胞內鈣超載，導致包括心律失常在內的多種心肌病理改變[7,8]。

圖2 A 加入哇巴因（5 μmol/L、4 ml）后的心電圖B a.加藥前 b.早搏 c.室速 d.室顫

圖3 KB-R7943對哇巴因誘發(fā)心衰家兔心律失常的影響

表3 各組家兔心律失常發(fā)生時間的比較（±s）

表3 各組家兔心律失常發(fā)生時間的比較（±s）

注：與對照組相比，aP<0.05；與哇巴因組相比，bP<0.05；與哇巴因+KBR7943（1 μmol/L）組比較，cP<0.05

組別 例數 TT（s） VT（s） VF（s）心衰對照組 8 27.5±8.6 10.1±7.4 0.25±0.70哇巴因組（5 μmol/L、4 ml） 8 1427.3±77.3a254.3±17.8a18.60±7.10a哇巴因+KB-R7943（1 μmol/L） 8 766.1±10.3b167.2±11.9b6.80±2.90b哇巴因+KB-R7943（5 μmol/L） 8 343.0±18.9bc44.1±18.5bc3.10±1.80b

本研究表明，給予過量哇巴因后可誘發(fā)心衰心臟發(fā)生明顯的心律失常。關于哇巴因誘發(fā)心律失常的機制，目前認為，哇巴因通過抑制鈉-鉀泵，細胞內Na+蓄積，引起依賴于鈉-鈣交換反向模式的細胞內鈣超載。細胞內鈣超載可促進肌漿網振蕩性鈣釋放而產生一種致心律失常的暫時性內流（Transient inward current，ITI）。據報道，ITI的組成可能包括鈉-鈣交換電流、非選擇性陽離子流和鈣激活的氯電流[9,10]。本研究選取NCX為靶點，通過抑制其功能，觀察抑制NCX對洋地黃中毒性心律失常的影響。結果表明，給予鈉-鈣交換阻斷劑KBR7943后，由過量哇巴因誘發(fā)心衰兔的心律失常發(fā)生時間明顯降低，且加入5 μmol/L KB-R7943，心律失常發(fā)生時間要明顯少于KB-R7943（1 μmol/L）組。我們推測，這可能與過量哇巴因灌注引起細胞內鈣超載后，KB-R7943使舒張期內鈣減少，消除了隨后的鈣振蕩引起的心律失常有關[11,12]。

目前關于KB-R7943對洋地黃性心律失常影響的研究仍較少，且多用健康大鼠或豚鼠建立心律失常模型。Watano等[10]用正常豚鼠離體心臟為標本，通過研究發(fā)現(xiàn)，給予KB-R7943可對抗哇巴因所誘發(fā)的心律失常，并在進一步實驗中發(fā)現(xiàn)靜脈注射KB-R7943可抑制麻醉豚鼠哇巴因中毒所致的心律失常。Satoh等[13]證實，KB-R7943對大鼠心肌中的鈣超載也同樣有抑制作用。然而，一方面鼠與人種屬差異較大；另一方面，與正常心臟相比，心衰狀態(tài)下多種離子通道（如L-型鈣通道、鈉鈣交換體、鈉通道、瞬時外向鉀通道等）均發(fā)生結構或（和）功能上的適應性改變，這些改變在發(fā)揮代償功能的同時也將成為心衰時各種新的心律失常發(fā)生的誘因[14-16]。本實驗選用家兔為實驗動物，在建立心力衰竭模型的基礎上，觀察NCX阻斷劑KB-R7943對洋地黃性心律失常的影響。與以往研究相比，本研究不同之處在于，首先，本研究使用家兔作為實驗動物。與鼠類相比，兔與人種屬更接近，從而減小了實驗動物與人的種屬差異性。其次，本研究在建立心衰模型的基礎上，觀察了KB-R7943對哇巴因誘發(fā)心律失常的影響，這比對健康動物誘發(fā)心律失常更符合臨床客觀實際情況，因而也更具臨床實際意義。

綜上所述，鈉-鈣交換體阻斷劑KB-R7943可減輕心衰家兔離體心臟哇巴因誘發(fā)的心律失常，且較高濃度（5 μmol/L）KB-R7943 較低濃度（1 μmol/L）對心衰家兔哇巴因誘發(fā)心律失常的抑制效應更強。本研究為臨床使用洋地黃治療心衰時如何有效預防或減輕其中毒所致心律失常提供了實驗依據。

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The inhibitory effect of KB-R7943 on ouabain induced arrhythmia in rabbits with heart failure

GAO Ya-nan＊， ZHAO Lei， LU Zhi-yao， et al.＊Department of Physiology， Key Laboratory of Cellular Physiology of Shanxi Province and Ministry of Education，Taiyuan 030001，China

Objective To investigate the effect of KB-R7943， a potent inhibitor of the Na+/Ca2+exchanger， on ouabain-induced arrhythmia in heart failure in rabbits．Methods 40 adult rabbits were randomly divided into five groups：sham-operated（ sham， n=8）， heart failure in the control（ HF， n=8）， ouabain（ n=8）， ouabain plus KB-R7943（ 1 μmol/L， n=8） and oubain plus KB-R7943（ 5 μmol/L， n=8） groups.The heart failure models were established by aortic insufficiency combined with abdominal aorta constriction.Eight weeks after operation，cardiac function were detected using cardiac ultrasound and Langendorff-perfused system both in anaesthetized and in isolated rabbit hearts.Cardiac arrhythmias was induced with ouabain （ 5 μmol/L， 4 ml） and effects of KBR7943 at 1 μmol/L and 5 μmol/L， respectively on ouabain-induced arrhythmia were observed in failing hearts.Results ⑴Compared with the sham group，it was showed that the left ventricular ejection fraction（LVEF）and fractional shortening rate （%FS） in HF group were significantly reduced by ultrasound detection（P<0.05）.⑵Compared with sham group， left ventricular developed pressure（ LVDP）， heart rate（ HR）， the maximal rising rate of left ventricular pressure（ +dp/dtmax） and the maximal falling rate of left ventricular pressure（ -dp/dtmax） all decreased in Langendorff-perfused hearts in HF group （ P<0.05）. ⑶Duration of the total arrhythmias time（ TT），ventricular tachycardia（VT） and ventricular fibrillation（VF） in ouabain group increased significantly than in HF group（ P<0.05）.⑷Durations of TT， VT and VF decreased significantly in oubain plus KB-R7943 groups when compared with ouabain group （ P<0.05）.Compared with 1 μmol/L KB-R7943 group， TT， VT and VF durations were further reduced in 5 μmol/L KB-R7943 group.Conclusion Sodium-calcium exchanger inhibitor KB-R7943 reduces the durations of arrhythmia induced by ouabain in isolated failing hearts in rabbits， and the inhibitory effect of high concentrations（ 5 μmol/L） KB-R7943 is stronger.

Na+/Ca2+exchanger； KB-R7943； Heart failure； Arrhythmias； Ouabain

FENG Qi-long， E-mail：fengqilong@163.com

山西省優(yōu)秀青年學術帶頭人基金；山西省高?！?31”領軍人才工程項目基金

封啟龍，E-mail：fengqilong@163.com

10．3969/j．issn．1672－5301．2014．05．016

Q95-33；R541.6

A

1672-5301（2014）05-0449－05

2014-01-29）