孫正魁 張 超 鄒學(xué)森 徐宗全 姜桂香 董 赟

特殊富含AT序列結(jié)合蛋白1(special AT rich sequence binding protein,SATB1)的表達(dá)與乳腺癌的不良預(yù)后和化療耐藥相關(guān)[1]，本研究構(gòu)建人SATB1 基因慢病毒表達(dá)載體，評(píng)價(jià)其在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)水平和對(duì)乳腺癌細(xì)胞侵襲性的影響，為進(jìn)一步研究SATB1 在乳腺癌中的作用及機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

DMEM 培養(yǎng)基(Gibco，美國)；胎牛血清(Hy-clone，美國)；GV287 載體(含綠色熒光蛋白GFP)、pHelper 1.0載體、pHelper 2.0載體、293T細(xì)胞、PCR引物(上海吉?jiǎng)P基因技術(shù)有限公司)；Taq 聚合酶(Takara，日本)；QIAGEN Plasmid 大抽Kit(QIAGEN，德國)；瓊脂糖(北京賽百盛基因技術(shù)有限公司)；DNA ladderMarker(上海捷瑞生物工程有限公司)；T4 DNA 連接酶、AgeⅠ、BamHⅠ(NEB，美國)；脂質(zhì)體Lipofectamine 2000 (Invitrogen，美國)；Western blot 檢測(cè)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；SATB1單克隆抗體(Santa Cruz Biotechnology，美國)。

1.2 方法

1.2.1 SATB1 基因獲取和真核表達(dá)載體酶切 參考GeneBank 的SATB1 基因序列(NM-002971.4)設(shè)計(jì)出合成一對(duì)SATB1 基因引物。引物序列：上游引物5'-GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGGATCATT

TGAACGAGGCAAC-3'，下游引物5'-TCCTTGTAGTCCATACCGTCTTTCAAATCAGTATTAATGTC-3'。抽提人SATB1cDNA，并以此為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。

1.2.2 GV287-SATB1 重組質(zhì)粒構(gòu)建、擴(kuò)增、鑒定 通過限制性內(nèi)切酶AgeⅠ(ACCGGT)和BamH Ⅰ(GGATCC)使慢病毒表達(dá)質(zhì)粒GV287 載體線性化，通過T4 DNA 連接酶將線性化的載體和DNA 構(gòu)建為帶有目的基因SATB1 序列的質(zhì)粒載體。連接后的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)篩選后，挑取單克隆并擴(kuò)大培養(yǎng)以進(jìn)行PCR 鑒定及測(cè)序。

1.2.3 病毒顆粒包裝和濃縮 將對(duì)數(shù)生長期的293T細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿，培養(yǎng)24 h使密度達(dá)70%～80%，加入所制備的各DNA溶液(GV287-SATB1 20 μg，pHelper 1.0載體15 μg，pHelper 2.0載體10 μg)、相應(yīng)體積的Opti-MEM、Lipfectamine 2 000試劑(100 μl)。收集轉(zhuǎn)染48 h后的293T細(xì)胞上清液。離心除去細(xì)胞碎片，過濾上清液，離心得到需要的病毒濃縮體積。分裝保存病毒濃縮液，-80℃保存。

1.2.4 病毒轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞 取處于對(duì)數(shù)生長期的MCF-7細(xì)胞接種于6 孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞生長融合約70%左右進(jìn)行轉(zhuǎn)染。共分為3 組：MCF-7細(xì)胞對(duì)照組；轉(zhuǎn)染單純含GFP 病毒液組；轉(zhuǎn)染含有目的基因SATB1組。轉(zhuǎn)染條件：每孔1 mL培養(yǎng)基，含10% 胎牛血清，109 TU/mL 病毒液(7 μL)，轉(zhuǎn)染12 h 后倒去培養(yǎng)基，PBS 清洗，加入2 mL完全培養(yǎng)基，48 h后更換完全培養(yǎng)基，熒光顯微鏡下檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。大量擴(kuò)增細(xì)胞，備用。

1.2.5 Western blot 檢測(cè)SATB1 蛋白表達(dá) 以細(xì)胞裂解液裂解篩選后的細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，測(cè)定蛋白的濃度，制備SDS-PAGE 膠，每泳道加入20 μg總蛋白，電泳。轉(zhuǎn)至PVDF 膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，加一抗(SATB1單抗)孵育，4 ℃過夜，次日室溫下1 h，PBST 清洗5次，5 min/次，加二抗，室溫2 h，PBST 清洗3次，10 min/次;入化學(xué)發(fā)光劑，暗房曝光。

1.2.6 侵襲實(shí)驗(yàn) 采用Transwell小室，取上述3組的細(xì)胞，胰酶消化后用DMEM培養(yǎng)液懸浮。調(diào)整細(xì)胞密度至2.5×105/mL，加200 μL細(xì)胞懸液至上室，下室加入30%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液600 μL，每株細(xì)胞設(shè)3個(gè)復(fù)孔，24 h后用0.1%結(jié)晶紫染色，觀察穿過Transwell小室的細(xì)胞數(shù)量，作為評(píng)價(jià)侵襲能力的指標(biāo)。顯微鏡下計(jì)數(shù)每個(gè)小室的穿膜細(xì)胞數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

2 結(jié)果

2.1 PCR 擴(kuò)增SATB1

PCR 成功擴(kuò)增出SATB1 序列的DNA 片段，電泳可見大小約2 333 bp 的特異性條帶(圖1)。

SATB1為2333bp的擴(kuò)增條帶，M為Marker。

2.2 重組質(zhì)粒的鑒定

提取重組質(zhì)粒，以KL5911-P3 / EGFP-N-R為引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，得到910bp 的擴(kuò)增產(chǎn)物，即陽性克隆(圖2) 。陽性克隆測(cè)序由上海吉?jiǎng)P基因技術(shù)有限公司完成，測(cè)序結(jié)果與目標(biāo)序列完全一致。

a為陰性對(duì)照(ddH2O)；b為陰性對(duì)照(空載體自連對(duì)照組)；c為陽性對(duì)照(GAPDH)；M為Marker；1～5分別為SATB1 1～5號(hào)轉(zhuǎn)化子。

圖2 電泳鑒定PCR 產(chǎn)物

2.3 轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞后熒光顯微鏡觀察結(jié)果

以完全培養(yǎng)基篩選2周后大量擴(kuò)增細(xì)胞，倒置熒光顯微鏡(×200)觀察發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染后的大部分細(xì)胞均有GFP 表達(dá)，轉(zhuǎn)染效率達(dá)70%以上(圖3)。

圖3 轉(zhuǎn)染后熒光表達(dá)情況(免疫熒光×200)

2.4 Western blot 檢測(cè)SATB1 表達(dá)

將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞提取總蛋白，β-actin 作為內(nèi)參，結(jié)果顯示SATB1 轉(zhuǎn)染組較空白對(duì)照組及GFP對(duì)照組SATB1表達(dá)水平明顯上調(diào)(圖4)。

Cont為空白對(duì)照；GFP-cont為GFP 空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組；SATB1為目的基因轉(zhuǎn)染組。

圖4 Satb2 表達(dá)的Western bolt 結(jié)果

2.5 SATB1過表達(dá)對(duì)MCF-7細(xì)胞侵襲性的影響

采用Transwell法檢測(cè)轉(zhuǎn)染GV287-SATB1的MCF-7細(xì)胞的穿膜能力，結(jié)果顯示SATB1 轉(zhuǎn)染組較空白對(duì)照組及GFP對(duì)照組的穿膜細(xì)胞數(shù)顯著增加，P<0.01(圖5)。

Cont為空白對(duì)照；GFP-cont為GFP 空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組；SATB1為目的基因轉(zhuǎn)染組。

圖5 SATB1過表達(dá)對(duì)MCF-7細(xì)胞侵襲性的影響

3 討論

乳腺癌的發(fā)病率逐年上升，現(xiàn)居女性惡性腫瘤首位[2]。采用目前治療方法，療效仍不盡如人意，重要臟器的轉(zhuǎn)移是造成乳腺癌死亡的原因，與乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的生物學(xué)標(biāo)志物是目前乳腺癌研究的熱點(diǎn)。

SATB1是1種組織特異性表達(dá)的核基質(zhì)結(jié)合蛋白，編碼基因位于3號(hào)染色體3P23區(qū)，能以非常高的親和力與核基質(zhì)結(jié)合區(qū)的ATC序列相結(jié)合，參與染色質(zhì)重塑、DNA甲基化和組蛋白乙酰化，調(diào)控多種基因表達(dá)[3]。Han等用免疫組化的方法發(fā)現(xiàn)在人乳腺癌組織細(xì)胞核中有SATB1的異常顯著表達(dá)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)表達(dá)水平不僅與乳腺癌的惡性程度呈正相關(guān)，而且在其表達(dá)的同時(shí)能上調(diào)乳腺組織中1000余種基因的表達(dá)，可能成為控制乳腺癌轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵蛋白[4]。因此，研究SATB1在乳腺癌組織中的生物功能具有十分重要的意義。

慢病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞具有能夠轉(zhuǎn)染非分裂期細(xì)胞，體內(nèi)較長期穩(wěn)定的表達(dá)，免疫反應(yīng)小，安全性較好等優(yōu)點(diǎn)[5]。本研究成功構(gòu)建表達(dá)SATB1蛋白的慢病毒載體GV287-SATB1。該慢病毒載體使用的病毒包裝系統(tǒng)由GV287、pHelper 1.0和pHelper 2.0組成。其中，GV287質(zhì)粒中含有PUbi啟動(dòng)子，能在宿主細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)SATB1，同時(shí)該質(zhì)粒能表達(dá)由PSV40啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GFP，可用于病毒包裝時(shí)轉(zhuǎn)染效率及感染目的細(xì)胞的感染效率的檢測(cè)，pHelper1.0和pHelper2.0載體則表達(dá)病毒結(jié)構(gòu)和包裝所需要蛋白。

本研究采用的MCF-7乳腺癌細(xì)胞株是從一例69歲的白人女性乳腺癌患者的胸腔積液中分離建立的，該細(xì)胞保留了多個(gè)分化乳腺上皮的特性，表達(dá)雌激素受體，侵襲性較弱[6]，是在乳腺癌研究中被廣泛應(yīng)用的代表性細(xì)胞株。我們發(fā)現(xiàn)GV287-SATB1慢病毒載體能夠被高效率的轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞并在MCF-7細(xì)胞中過表達(dá)SATB1蛋白，過表達(dá)SATB1的MCF-7細(xì)胞侵襲性顯著增強(qiáng)。為進(jìn)一步研究SATB1基因?qū)θ巳橄侔┘?xì)胞生物學(xué)行為的影響并探討其機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

[1] Yamayoshi A,Yasuhara M,Galande S,et al.Decoy-DNA against special AT-rich sequence binding protein 1 inhibits the growth and invasive ability of human breast cancer〔J〕.Oligonucleotides,2011,21(2):115-121.

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