李琳+李坤+王福強(qiáng)+丁寧

[摘要] 目的 構(gòu)建針對人核糖核酸酶抑制因子（hRI）的shRNA逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，為探討hRI抗腫瘤作用機(jī)制打下基礎(chǔ)。 方法 用亞克隆法將目的片段pkd-dsRI和pkd從表達(dá)載體pKD-dsRI克隆到pLNCX上，用雙酶切篩選得到陽性克隆后，用脂質(zhì)體法將其轉(zhuǎn)染到人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞中，用800 mg/L G418篩選2周，產(chǎn)生穩(wěn)定的細(xì)胞克隆后，用RT-PCR檢測細(xì)胞中核糖核酸酶抑制因子mRNA表達(dá)的變化。 結(jié)果 雙酶切鑒定為陽性克隆。RT-PCR表明，對比空白組（0.790±0.014）和空載體組（0.904±0.027），干擾組hri基因表達(dá)（0.361±0.048）明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。 結(jié)論 成功構(gòu)建了針對hRI的shRNA逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。

[關(guān)鍵詞] 人核糖核酸酶抑制因子；shRNA；逆轉(zhuǎn)錄病毒載體；構(gòu)建

[中圖分類號] R394.33[文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A[文章編號] 1673-7210（2014）05（b）-0014-04

Construction and identification of retroviral vector expressing shRNA targeting hRI gene in HepG2 cell

LI Lin1 LI Kun2▲ WANG Fuqiang3 DING Ning2

1.Department of Laboratory Medicine, Maternal and Child Care Service Centre of Dalian City, Liaoning Province, Dalian 116021, China; 2.School of Medicine, Dalian University, Liaoning Province, Dalian 116021，China; 3.Dalian Ocean University, Liaoning Province, Dalian 116021, China

[Abstract] Objective To construct the retroviral vector expressing shRNA targeting hRI gene, in order to provide basis for discussion of hRI antitumor effect. Methods The target fragments of pkd-dsRI and pkd from the vectors of pKD-dsRI were subcloned into the retroviral vector pLNCX respectively. The vector was identified by enzyme digested, then transfected into HepG2 cells with liposome method. After 2 weeks of selection of 800 mg/L G418, the silencing effect of the siRNA plasmid was identified by RT-PCR on the HepG2 cells. Results Restriction enzyme digestion proved that the construction of retroviral vector expressing shRNA targeting hRI gene was correct. RT-PCR showed that the expression of hri gene were significantly reduced in the HepG2 cells transfected with shRNA-hRI retroviral vector (0.361±0.048) as compared with the blank control group (0.790±0.014) and the blank retroviral vector group (0.904±0.027), with statistically significant difference (P < 0.05). Conclusion The retroviral vector expressing shRNA targeting hRI gene is successfully constructed.

[Key words] Human ribonuclease inhibitor; shRNA; Retroviral expression vector; Construction

人核糖核酸酶抑制因子（human ribonuclease inhibitor，hRI）是廣泛存在于哺乳動物胞漿內(nèi)的酸性糖蛋白，基因定位于11p15.5，分子量為50 kD[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，hRI是核糖核酸酶（RNase A）的抑制劑（Ki=4.0×10-14 mol/L），能有效抑制RNase A對RNA的水解[3]。hRI還可以與血管生長因子（Angiogenin，Ang）緊密結(jié)合（Ki=7.1×10-16 mol/L）而抑制Ang促血管生成的活性[3-4]。此外，hRI還具有抗機(jī)體氧化損傷功能[5]。綜合國內(nèi)外的研究，本課題組認(rèn)為hRI能通過抑制Ang活性而抑制腫瘤新血管生成，對于腫瘤的生長、浸潤及轉(zhuǎn)移等過程具有抑制作用，推測其可能為腫瘤抑制基因的候選者之一。

為了證明hRI是否是腫瘤抑制因子，本研究將已構(gòu)建的針對hRI基因的siRNA表達(dá)載體pKD-dsRI[6]的H1 Promotor和MCS區(qū)段亞克隆至逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLNCX的MCS中，獲得有新霉素抗性的干擾載體pLNCX-pKD-dsRI，為下一步探討hRI抗腫瘤作用及抗腫瘤基因治療的應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

質(zhì)粒pLNCX、E.coli DH5α由大連大學(xué)醫(yī)學(xué)院（以下簡稱“我院”）生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室保存；針對人核糖核酸酶抑制因子siRNA表達(dá)載體pKD-dsRI（圖1）由我院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室構(gòu)建。

圖1 siRNA表達(dá)載體pKD-dsRI

限制性內(nèi)切酶、DNA Marker、T4DNA連接酶購自TaKaRa；DNA快速凝膠產(chǎn)物回收試劑盒購自博大泰克公司；瓊脂糖、氨芐青霉素和鏈霉素購自華美生物公司；LB培養(yǎng)基購自Invitrogen/GIBCO；G418和RT-PCR kit購自BBI；CellfectinR購自Invitrogen；Trizol、DEPC H2O購自上海生物工程有限公司；核酸序列分析軟件primer 5.0、質(zhì)粒繪制軟件plasmid 2.0。

1.2 方法

1.2.1 重組載體pLNCX-pKD-dsRI的構(gòu)建及鑒定質(zhì)粒pLNCX用Hind Ⅲ單酶切質(zhì)粒pLNCX、Klenow Fragment和dNTP補(bǔ)平、CIAP去除5'-磷酸末端后，用乙醇沉淀法回收得到約6.2 kb的平末端的線性化、去磷酸化的載體大片斷。質(zhì)粒pKD-dsRI用PvuⅡ酶切后，經(jīng)1%瓊脂糖電泳切膠回收，獲得目的片斷（H1 Promotor-dsRI）；同樣處理pKD，獲得目的片斷（H1 Promotor-MCS）。載體與片段用T4 DNA連接酶連接、轉(zhuǎn)化后，獲得重組載體pLNCX-pKD-dsRI。用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切pLNCX-pKD-dsRI，篩選得到正向連接的陽性克隆。挑取單克隆，提取質(zhì)粒，用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切pLNCX-pKD-dsRI，篩選得到正向連接的陽性克隆。將酶切篩選陽性克隆送TaKaRa測序鑒定。

1.2.2 HepG2細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，補(bǔ)加0.03%谷氨酰胺，0.2% NaHCO3，0.59% Hepes（pH 7.2）， 10%熱滅活（56℃，30 min）的胎牛血清及雙抗（青霉素和鏈霉素各100 U/mL），培養(yǎng)條件為5％的CO2，培養(yǎng)溫度37 ℃。細(xì)胞按4×104個/孔鋪板于24孔板，至90%~95%匯片時，按CellfectinR說明書轉(zhuǎn)染并分組：①空白組（正常細(xì)胞）；②空載體組（pLNCX-pKD載體轉(zhuǎn)染組）；③干擾組（pLNCX-pKD-dsRI載體轉(zhuǎn)染組），每組2復(fù)孔。每組質(zhì)粒共用0.8 μg、脂質(zhì)體2 μL，轉(zhuǎn)染后24 h，換成含600 μg/mL G418的培養(yǎng)基培養(yǎng)選擇2周，挑取G418的抗性單克隆，繁殖、擴(kuò)增。

1.2.3 mRNA轉(zhuǎn)錄水平的檢測采用Trizol試劑分別提取各孔中細(xì)胞的總RNA。使用RT-PCR試劑盒按照兩步法進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。以總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。用于檢測內(nèi)源表達(dá)的RT-PCR引物：5'-gacatccagtgtgaggagctgagcg-3'，5'-ccagcctcattgatgtcgttgttgc-3'，上游引物位于hri基因的No.27 bp，下游引物位于hri基因的No.559 bp，產(chǎn)物長度約為527 bp。β-actin引物 5'- gctgtccctgtacgcctctg-3'，5'-tgccgatggtgatgacctgg-3'，產(chǎn)物長度約為300 bp。由Bio-Rad凝膠成像儀攝取圖像，Image LabTM軟件對各個條帶測定其面積及灰度值。用目的基因條帶灰度值與β-actin條帶灰度值的比值表示目的基因的相對表達(dá)強(qiáng)度。干擾率=（相對表達(dá)強(qiáng)度空載體組-相對表達(dá)強(qiáng)度干擾組）/相對表達(dá)強(qiáng)度空載體組。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS 11.5統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 重組載體pLNCX-pKD-dsRI的構(gòu)建及鑒定

2.1.1 重組載體pLNCX-pKD-dsRI的構(gòu)建質(zhì)粒pKD-dsRI用PvuⅡ酶切后獲得約618 bp的目的片斷pkd-dsRI；同樣處理pKD，獲得約534 bp的目的片斷pkd（圖2）。質(zhì)粒pLNCX用HindⅢ單酶切質(zhì)粒pLNCX、Klenow Fragment和dNTP補(bǔ)平和CIAP去除5'-磷酸末端后，回收得到約6.2 kb的平末端的線性化、去磷酸化載體大片斷（圖3）。

M1：DL2000 Marker；1：pKD-dsRI/PVUⅡ；2：pKD/PVUⅡ

圖2 質(zhì)粒pKD-dsRI、pKD單酶切電泳圖

M1：λ-EcoT14 Ⅰdigested DNA Marker；1：pLNCX/HindⅢ

圖3 質(zhì)粒pLNCX單酶切電泳圖

2.1.2 酶切鑒定陽性重組質(zhì)粒pLNCX-pKD-dsRI-Neor和pLNCX-pKD-Neor用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切pLNCX-pKD-dsRI，得到5523 bp和1305 bp兩條片段（圖4）；同樣處理pLNCX-pKD-dsRI，得到5523 bp和1221 bp兩條片段（圖5）。

M1：DL2000 Marker；M2：λ-EcoT14Ⅰdigested DNA Marker；1：pLNCX-pKD-neor/BamHⅠ+XhoⅠ

圖4 pLNCX-pKD-dsRI-neor雙酶切電泳圖

M1：DL2000 Marker；M2：λ-EcoT14Ⅰdigested DNA Marker；1：pLNCX-pKD-dsRI-neor/BamHⅠ+ XhoⅠ（5523 bp和1221bp）；2：plasmid of pLNCX-pKD-neor

圖5 pLNCX-pKD-neor雙酶切電泳圖

2.2 mRNA轉(zhuǎn)錄水平的檢測

RT-PCR結(jié)果顯示，空白組hri基因的相對表達(dá)強(qiáng)度為0.790±0.014，空載體組的相對表達(dá)強(qiáng)度為0.904±0.027，干擾組的相對表達(dá)強(qiáng)度為0.361±0.048。與空白組和空載體組對比，干擾組中hri基因均顯著下調(diào)（P < 0.05），抑制率大于80%?？梢姡琱ri基因在轉(zhuǎn)錄后水平上分別被沉默（圖6）。

M：DL2000 Marker；1：空白組中β-actin的表達(dá)；2：空白組中hri基因的表達(dá)；3：空載體組中β-actin的表達(dá)；4：空載體組中hri基因的表達(dá)；5：干擾組中hri基因的表達(dá)被干擾；6：干擾組中β-actin的表達(dá)

圖6 RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染hri基因在HepG2細(xì)胞中的表達(dá)

3討論

RNA干擾（RNA interference，RNAi）是雙鏈RNA（double-strand RNA，dsRNA）介導(dǎo)的序列特異的轉(zhuǎn)錄后基因沉默（posttranscriptional gene silencing， PTGS）現(xiàn)象。2001年Elbashir等[7]證明合成的雙鏈siRNA在哺乳動物細(xì)胞中可實現(xiàn)靶基因特異沉默作用，由此RNAi被廣泛用于特異基因的生物學(xué)功能的研究。目前常用的siRNA的制備方法有化學(xué)合成法、體外轉(zhuǎn)錄法、RNase Ⅲ消化法、siRNA質(zhì)粒表達(dá)載體法、siRNA表達(dá)盒細(xì)胞內(nèi)表達(dá)法等[8]，其中，質(zhì)粒載體表達(dá)siRNA法，最常利用哺乳動物細(xì)胞啟動子RNA聚合酶Ⅲ依賴的啟動子如鼠和人U6-snRNA啟動子、人RNase P（H1）啟動子、人Val-tRNA啟動子等調(diào)控表達(dá)siRNA或shRNA，但存在轉(zhuǎn)染效率低等問題。由于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體能將外源基因有效地整合到宿主細(xì)胞基因組中，并隨細(xì)胞分裂而傳給后代，所以使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染可以獲得長期穩(wěn)定的RNA干擾效果[9]。如Clontech的RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-DsRed-Express[10]、Oligoengine的pSUPER retro[11]、TaKaRa的pSINsi系列載體、Ambion公司的pSilencerTM 5.1 Retro[12]等?；?002年Xia[13]等報道，細(xì)胞內(nèi)RNA聚合酶Ⅱ依賴的啟動子也能高效表達(dá)siRNA，Ambion公司的RNAi載體pSilencerTM 4.1-CMV neo利用改良Cytomegalomavirus （CMV）啟動子表達(dá)shRNA，也實現(xiàn)了穩(wěn)定RNA干擾作用。

本研究在瞬時載體pKD-dsRI基礎(chǔ)上，將pKD的H1 promoter及其下游的MCS序列亞克隆至逆轉(zhuǎn)錄病毒pLNCX的MCS中，得到耐受新霉素的穩(wěn)定表達(dá)沉默hRI的載體pLNCX-pKD-dsRI-neor。雙酶切鑒定及在HepG2細(xì)胞內(nèi)RT-PCR結(jié)果表明了干擾hRI基因的穩(wěn)定表達(dá)載體構(gòu)建成功。這為以后研究hRI基因的抗腫瘤作用及在基因治療中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

[參考文獻(xiàn)]

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[12]尹昌林，呂勝青，黃軼，等.pSiRNA-Notch1逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建及對惡性腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的作用[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2007，29（12）：1211-1214.

[13]Xia H，Mao Q，Paulson H，et al. siRNA-mediated gene silencing in vitro and in vitro [J]. Nat Biotechnol，2002，20：1006-1010.

（收稿日期：2014-02-27本文編輯：程銘）

[基金項目] 遼寧省教育廳科學(xué)研究一般項目（編號L2011219）；大連大學(xué)本科生創(chuàng)新課題（編號2013108）。

[作者簡介] 李琳（1974-），碩士，副主任檢驗師；研究方向：分子生物學(xué)。

▲通訊作者

[參考文獻(xiàn)]

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（收稿日期：2014-02-27本文編輯：程銘）

[基金項目] 遼寧省教育廳科學(xué)研究一般項目（編號L2011219）；大連大學(xué)本科生創(chuàng)新課題（編號2013108）。

[作者簡介] 李琳（1974-），碩士，副主任檢驗師；研究方向：分子生物學(xué)。

▲通訊作者

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[13]Xia H，Mao Q，Paulson H，et al. siRNA-mediated gene silencing in vitro and in vitro [J]. Nat Biotechnol，2002，20：1006-1010.

（收稿日期：2014-02-27本文編輯：程銘）

[基金項目] 遼寧省教育廳科學(xué)研究一般項目（編號L2011219）；大連大學(xué)本科生創(chuàng)新課題（編號2013108）。

[作者簡介] 李琳（1974-），碩士，副主任檢驗師；研究方向：分子生物學(xué)。

▲通訊作者