張春燕+趙志英+張向榮+田恒文+崔俊梅+阿拉騰+吳騰

[摘要] 目的 觀察姜黃素對(duì)阿爾茨海默?。ˋD）大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的改善，以了解其對(duì)AD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響與大腦皮質(zhì)內(nèi)NF-κB及Bcl-2和Bax表達(dá)的關(guān)系，從而探討姜黃素治療AD的可能機(jī)制。 方法 將90只大鼠隨機(jī)分為6組，AD模型組、AD模型＋姜黃素低劑量組、AD模型＋姜黃素中劑量組、AD模型＋姜黃素高劑量組、假手術(shù)組和正常對(duì)照組，每組各15只。各組大鼠均通過(guò)Morris水迷宮觀察其學(xué)習(xí)記憶能力的改變；采用免疫組織化學(xué)方法結(jié)合圖像分析觀察各組大鼠大腦皮質(zhì)的NF-κB免疫反應(yīng)性細(xì)胞的表達(dá)變化，采用Western blot方法檢測(cè)各組大鼠大腦皮質(zhì)Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)。 結(jié)果 姜黃素可有效改善AD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，并呈劑效關(guān)系，大劑量的效果更好。姜黃素可以縮短AD模型大鼠水迷宮測(cè)試的潛伏期（P<0.05），姜黃素低、中、高劑量治療組大鼠尋找目標(biāo)象限所需時(shí)間縮短；免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示：模型組NF-κB蛋白表達(dá)較對(duì)照組降低（P<0.01）；姜黃素各劑量組NF-κB蛋白表達(dá)較模型組增高（P<0.05），且姜黃素高劑量組高于姜黃素低劑量組（P<0.05）。Western blot結(jié)果顯示：Bcl-2蛋白與NF-κB在各組大鼠大腦皮質(zhì)中的表達(dá)趨于一致；模型組Bcl-2蛋白表達(dá)與正常對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；姜黃素各劑量[30、60、100 mg/（kg·d）]組Bcl-2蛋白表達(dá)較模型組分別增加14.56%、22.12%和32.87%（P<0.05）。AD模型組大鼠大腦皮質(zhì)Bax蛋白表達(dá)與正常對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；姜黃素不同劑量[30、60、100 mg/（kg·d）]組Bax蛋白表達(dá)與AD模型比較，分別減少26.37%、37.56%和47.32%（P<0.05）。 結(jié)論 姜黃素可效改善AD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，且隨著劑量的增加治療效果改善更加明顯；姜黃素促進(jìn)Bcl-2的上調(diào)及Bax的減少可能是姜黃素改善AD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的機(jī)制之一；姜黃素可通過(guò)激活大腦皮質(zhì)NF-κB途徑調(diào)控凋亡調(diào)節(jié)基因的表達(dá)而發(fā)揮對(duì)AD的治療作用。

[關(guān)鍵詞] 姜黃素；阿爾茨海默病；核轉(zhuǎn)錄因子-κB；凋亡調(diào)控因子；免疫組織化學(xué)；Morris水迷宮

[中圖分類號(hào)] R965.1[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A[文章編號(hào)] 1674-4721（2014）04（c）-0004-05

Relationship between amelioration of curcumin on learning and memory ability and the contents of NF-κB and Bcl-2,Bax in cortex of AD rats

ZHANG Chun-yan1 ZHAO Zhi-ying2▲ ZHAN Xiang-rong3 TIAN Heng-wen1 CUI Jun-mei1 ALA Teng1 WU Teng1

1.The Fourth Affiliated Hospital of Baotou Medical College,Inner Mongolia University of Science and Technology;The Eighth Hospital of Baotou City,Baotou 014010,China;2.Baotou Medical College of Inner Mongolia University of Science and Technology,Baotou 014010,China;3.Baogang No.3 Hospital,Baotou 014010,China

[Abstract] Objective To observe the amelioration and mechanism of curcumin on the learning and memory ability of AD rats,in order to understand the impact of AD rats learning and memory abilities and brain cortex NF-κB,Bax and Bcl-2 expression and the relationship between so as to explore the possible mechanism of curcumin to treat AD. Methods 90 SD rats were divided randomly into the control group,imitated operating group,AD model group,AD model plus curcumin low level group,AD model plus curcumin low middle group,AD model plus curcumin high level group,each group of 15 rats.Groups of rats were observed by Morris water maze changes in its learning and memory ability.The immunohistochemical method and combining with image were Used to analysis to observe each rat cerebral cortex of the NF-κB changes the expression of cell immune response,the Western blot method was used to detect the Bcl-2 each rat brain cortex and the expression of Bax protein.Results Curcumin had ability of therapy on AD,curcumin could ameliorate the learning and memory ability of AD rats,and showed dose dependence.Curcumin could shorten the incubation period of experimental rats testing in water maze.Immunohistochemical results showed:the expression of NF-κB was degraded in the cortex of AD model rats compare with the control group (P<0.01).Curcumin could raise the expression of NF-κB in the cortex of AD model rats (P<0.05),and AD model plus curcumin high group was higher than low level group (P<0.05).The Bcl-2 protein and the NF-κB in each group to have consistent expression in cortex of rats,the Bcl-2 protein in the model group expression differences compared with normal control group was statistically significant (P<0.01).Curcumin each dose [30,60,100 mg/(kg·d)] group the Bcl-2 protein expression increased by 14.56%,22.12% and 32.87% respectively than model group (P<0.05).Bax protein expression in the rat brain cortex AD model group compared with normal control group,the difference was statistically significant (P<0.01).Curcumin each dose [30,60,100 mg/(kg·d)] group Bax protein expression and AD model was reduced by 26.37%,37.56% and 47.32% respectively (P<0.05). Conclusion Curcumin has the therapeutic action to AD,and improve the learning and memory ability of AD rats.The therapeutic action ameliorated of curcumin to Alzheimer disease are related with decreased the expression of Bax and increased expression of Bcl-2.Curcumin has therapeutical effect on AD through regulating the expression of NF-κB and apoptosis related genes.

[Key words] Curcumin;Alzheimer disease;NF-κB;apoptosis related genes;Immunohistochemistry;Morris water maze

阿爾茨海默病（Alzheimer disease，AD）是老年期常見(jiàn)的疾病之一，其臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性記憶障礙，是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，目前研究認(rèn)為，各種原因引起的神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷、細(xì)胞凋亡、腦組織神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子含量降低等是AD的主要發(fā)病原因。大量研究資料證實(shí)，神經(jīng)細(xì)胞凋亡是AD神經(jīng)元丟失的主要原因[1]，細(xì)胞凋亡在AD發(fā)病機(jī)制中的作用是目前AD研究的一大熱點(diǎn)。

核因子-κB（NF-κB）廣泛存在于真核細(xì)胞中，是一類促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)的總稱。其對(duì)于AD的發(fā)生、發(fā)展有重要影響，近年來(lái)得到廣泛關(guān)注[2-3]。NF-κB通過(guò)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)發(fā)揮抗神經(jīng)細(xì)胞損傷作用，Bcl-2和Bax是參與該作用的凋亡調(diào)控基因，Bax是促進(jìn)凋亡，Bcl-2則抑制凋亡。其蛋白產(chǎn)物可以形成異二聚體或同二聚體，發(fā)揮不同的作用，兩者的含量之比決定最終的結(jié)果[4-5]。

姜黃素具有抗癡呆、抗氧化、降血脂等作用[6]，可減輕神經(jīng)細(xì)胞損傷[7]，其主要作用機(jī)制可能是下調(diào)APP和早老素-1表達(dá)，減少AD大鼠腦組織中Aβ的異常聚集。姜黃素抑制淀粉樣蛋白25～35（Aβ25～35）和1-甲基-4苯基吡啶離子（MPP+）誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡[8-9]。姜黃素具有多種抗炎作用，從而可以對(duì)AD等疾病進(jìn)行治療[10-11]。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察姜黃素對(duì)AD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的改善及其對(duì)AD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響與大腦皮質(zhì)內(nèi)NF-κB及Bcl-2和Bax的關(guān)聯(lián)，以探討姜黃素治療AD的機(jī)制，為姜黃素用于AD臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)健康雄性Wistar大鼠90只，體重200～250 g，購(gòu)自內(nèi)蒙古大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK（蒙）2002-0001。

1.1.2 主要試劑

兔抗大鼠NF-κB多克隆抗體（美國(guó)Santa Cruz公司），兔抗大鼠Bcl-2多克隆抗體（美國(guó)R＆D公司），兔抗大鼠Bax多克隆抗體（美國(guó)R＆D公司）。

1.1.3 藥物

姜黃素購(gòu)于瑞士Fluka公司（純度為99.9%）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組

將90只Wistar大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、假手術(shù)組（以等量生理鹽水代替Aβ25～35）、AD模型組、AD模型＋姜黃素低劑量組[腹腔給予40 mg/（kg·d）姜黃素，術(shù)后第2天開(kāi)始，共治療4周]、AD模型＋姜黃素中劑量組[腹腔給予60 mg/（kg·d）姜黃素]、AD模型＋姜黃素高劑量組[腹腔給予100 mg/（kg·d）姜黃素]，共6組，每組15只；正常對(duì)照組和假手術(shù)組腹腔注射與姜黃素等體積生理鹽水。

1.2.2 學(xué)習(xí)記憶能力的檢測(cè)及分析

Morris水迷宮為1個(gè)直徑150 cm、高60 cm的圓形水池，內(nèi)壁漆為黑色。池內(nèi)水深42 cm，水溫（22±1）℃。房間內(nèi)光照恒定，無(wú)光線反射在水池內(nèi)。將水池分為東北（EN）、東南（ES）、西北（WN）、西南（WS）4個(gè)象限，在EN象限中央距池壁35 cm處放置1個(gè)直徑8 cm、高40 cm的圓形透明站臺(tái)，站臺(tái)低于水面2 cm。迷宮上方安置與顯示系統(tǒng)連接的攝像機(jī)，受試動(dòng)物測(cè)試結(jié)果采用北京碩林苑科技有限公司開(kāi)發(fā)的動(dòng)物行為實(shí)驗(yàn)專用軟件處理。藥物治療2周后，用Morris水迷宮對(duì)大鼠進(jìn)行行為學(xué)檢測(cè)。

1.2.2.1 定位航行試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)前1 d，讓大鼠熟悉水迷宮環(huán)境。第2天開(kāi)始正式實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)歷時(shí)5 d，每天分上、下午2個(gè)時(shí)間段，每段時(shí)間訓(xùn)練4次，分別從ES、EN、WS、WN 4個(gè)點(diǎn)入水，試驗(yàn)時(shí)，選擇任一象限，將大鼠面部背向站臺(tái)沿池壁放入水中，計(jì)算尋找站臺(tái)的時(shí)間，如規(guī)定時(shí)間內(nèi)未找到平臺(tái)，則由實(shí)驗(yàn)者將其引向平臺(tái)，其潛伏期記為120 s。

1.2.2.2 空間探索試驗(yàn)將大鼠面向池壁放入水中，記錄大鼠在2 min內(nèi)的游泳軌跡，計(jì)算大鼠在原平臺(tái)象限的游泳距離占總游泳距離的百分比，以此判斷大鼠的記憶能力。

1.2.3 大鼠腦組織Bax和Bcl-2蛋白含量的測(cè)定

大鼠按400 mg/kg劑量腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠。斷頭處死，快速取出全腦，用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標(biāo)條帶與內(nèi)參照條帶凈吸光度的比值。

1.2.4 NF-κB免疫組織化學(xué)染色

1.2.4.1 組織制備動(dòng)物麻醉成功后，各組隨機(jī)取5只大鼠大腦，作恒冷箱冷凍切片，行NF-κB免疫組織化學(xué)染色。大鼠腦用振蕩切片機(jī)冠狀位連續(xù)切片，厚約30 μm。切片經(jīng)室溫風(fēng)干或電吹風(fēng)（冷風(fēng)）吹干后即可開(kāi)始作染色處理。

1.2.4.2 SABC法免疫組織化學(xué)染色①裱片陰干或冷風(fēng)吹干，經(jīng)PBS洗5次，每次10 min；②3%（H2O）6 SABC復(fù)合物，37℃孵育30 min，PBS洗2次，每次10 min，TBS洗1次，10 min；③DAB顯色1～5 min，注意避光，鏡下觀察染色，盡可能使背景染色一致，PBS洗5次，每次10 min，蒸餾水洗3次，每次5 min；④常規(guī)脫水，透明，樹膠封片；⑤陰性對(duì)照以PBS代替一抗，其他步驟不變。

1.2.4.3 NF-κB在腦組織表達(dá)的觀察和圖像分析用Olympus顯微鏡（CX-41）及形態(tài)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行觀察。選取3只大鼠的NF-κB免疫組織化學(xué)染色切片，每只動(dòng)物取相同位置5張腦片，在高倍物鏡下拍攝照片并觀測(cè)，計(jì)數(shù)NF-κB陽(yáng)性神經(jīng)元的數(shù)目和積分光密度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所得數(shù)據(jù)均采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢驗(yàn)，采用重復(fù)測(cè)量的單因素方差分析（Post－way RANOVA）比較各組大鼠尋找站臺(tái)的逃避潛伏期的差異，采用Tukey法兩兩比較組間差異，平臺(tái)象限游泳距離占總游泳距離的百分比采用One-way ANOVA單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 學(xué)習(xí)記憶能力的檢測(cè)結(jié)果

2.1.1 不同組大鼠逃避潛伏期的結(jié)果

模型組尋找平臺(tái)的時(shí)間最長(zhǎng)，平均逃避潛伏期為（78.36±17.45）s，與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；姜黃素低劑量組的尋找平臺(tái)時(shí)間與中劑量組、高劑量組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而高劑量組尋找平臺(tái)的時(shí)間與正常對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（表1）。

表1 各組大鼠尋找平臺(tái)平均潛伏期的比較（s，x±s）

與其他組比較，*P<0.01；與正常組比較，#P>0.05；與正常組、假手術(shù)組及高劑量組比較，△P<0.05

2.1.2 各組大鼠平臺(tái)象限游泳距離百分比的比較

模型組大鼠在平臺(tái)象限的游泳占總游泳時(shí)間的百分比為22.4%，正常組為45.3%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；姜黃素高劑量給藥組為40.8%，中劑量組為31.3%，主要集中在平臺(tái)象限，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.2 姜黃素對(duì)AD模型大鼠大腦皮質(zhì)NF-κB表達(dá)的影響

各組大鼠神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞均可見(jiàn)NF-κB免疫組織化學(xué)染色陽(yáng)性細(xì)胞。正常組大鼠大腦皮質(zhì)有較多NF-κB免疫組織化學(xué)染色陽(yáng)性細(xì)胞，在胞質(zhì)、胞核中均有表達(dá)，呈淺棕黃色，彌漫或顆粒狀分布（圖1）。AD模型組大鼠腦皮質(zhì)（圖2）較對(duì)照組NF-κB免疫組織化學(xué)染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量減少，染色變淺；姜黃素各給藥組與模型組相比，NF-κB免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量增加，染色加深（P<0.05）。模型組NF-κB陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)和平均積分光密度比正常對(duì)照組降低（P<0.01）；而姜黃素各給藥組NF-κB陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)和平均積分光密度顯著升高（P<0.05），且呈劑量依賴性，姜黃素低劑量組NF-κB陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)和平均積分光密度低于姜黃素高劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；姜黃素高劑量組NF-κB陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)和平均積分光密度高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表2、圖1～圖6）。