陳灝　詹建偉　王利民　陳清勇　葉健

[摘要] 目的 探討姜黃素對耐吉非替尼人肺腺癌PC9/ZD細(xì)胞的生物學(xué)特性影響以及干預(yù)其上皮間質(zhì)化過程（Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT）的相關(guān)機(jī)制。 方法 采用體外姜黃素作用于耐吉非替尼人肺腺癌PC9/ZD細(xì)胞；分別通過形態(tài)學(xué)、MTT法、transwell實(shí)驗(yàn)檢測經(jīng)姜黃素干預(yù)的耐藥細(xì)胞株的形態(tài)特征、藥物敏感性和侵襲轉(zhuǎn)移能力的變化；通過Western blot實(shí)驗(yàn)檢測波形蛋白、上皮鈣粘附分子在藥物作用后的表達(dá)差異以及PI3K/AKT/mTOR信號通路中相關(guān)蛋白 AKT、mTOR的變化情況。 結(jié)果 與人肺腺癌PC9細(xì)胞比較，PC9/ZD耐藥細(xì)胞株呈間質(zhì)樣細(xì)胞表型；與親代PC9/ZD細(xì)胞比較，經(jīng)姜黃素作用后的PC9/ZD細(xì)胞對吉非替尼敏感性明顯增強(qiáng)，轉(zhuǎn)移能力減弱（75.67±8.82 vs 103.67±13.67）；侵襲能力減弱（17.22±3.63 vs 59.89±8.19）；波形蛋白表達(dá)下調(diào)（1.07±0.23 vs 1.28±0.28），上皮鈣粘附分子表達(dá)上調(diào)（0.82±0.27 vs 0.29±0.11）；AKT、mTOR磷酸化減弱（0.20±0.05 vs 0.63±0.17，0.72±0.25 vs 1.10±0.19）。 結(jié)論 姜黃素可以通過阻斷PI3K/AKT/mTOR信號通路而明顯干預(yù)耐吉非替尼肺腺癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程。

[關(guān)鍵詞] 肺腺癌；吉非替尼耐藥；上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化；生物學(xué)特性；姜黃素

[中圖分類號] R285.5；R734.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701（2016）32-0001-04

吉非替尼作為一種常規(guī)治療肺癌的化療藥物，在臨床上有著不錯的療效，但還有很多肺癌患者會出現(xiàn)原發(fā)性耐藥或繼發(fā)性耐藥的現(xiàn)象。已有研究表明腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是其獲得耐藥能力的重要因素之一[1，2]。目前，姜黃素公認(rèn)為是姜黃中最有效和最豐富的活性成分之一。一方面，姜黃素的抗炎、抗凝、抗氧化等作用不斷被人們所證實(shí)[3]；另一方面，姜黃素的抗腫瘤機(jī)制也成為熱點(diǎn)[4]。本研究通過體外姜黃素作用于耐吉非替尼人肺腺癌PC9/ZD細(xì)胞，對其進(jìn)行分子生物學(xué)特性的檢測，分析其干預(yù)EMT過程的相關(guān)機(jī)制，旨在為進(jìn)一步研究姜黃素干預(yù)肺腺癌耐藥細(xì)胞發(fā)生EMT時所涉及的相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子或相關(guān)通路打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和材料

①吉非替尼（Gefitinib）（阿斯利康制藥有限公司產(chǎn)品）；②DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（Thermo公司產(chǎn)品）；③胰酶、PBS溶液（Hyclone公司產(chǎn)品）；④人結(jié)腸癌PC9細(xì)胞株（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）；⑤人肺腺癌耐吉非替尼PC9/ZD細(xì)胞株（同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院提供）；⑥甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）、山羊抗兔IgG二抗、β-actin（biosharp公司產(chǎn)品）；⑦M(jìn)atrigel膠、transwell小室、培養(yǎng)瓶、離心管（美國CORNING公司）；⑧E-cadherin、Vimentin、mTOR、p-mTOR、AKT、p-AKT、GAPDH一抗（Abcam公司）。

1.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)

采用倒置相差顯微鏡（OLYMPUS 200×）觀察人肺腺癌PC9細(xì)胞株和人肺腺癌耐吉非替尼PC9/ZD細(xì)胞株。

1.3 常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)

將處于對數(shù)生長期人肺腺癌耐吉非替尼PC9/ZD細(xì)胞株接種至5 cm×5 cm大小的培養(yǎng)瓶，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶80%左右進(jìn)行傳代?？蓪⒓?xì)胞凍存在-80℃的超低溫冰箱中，解凍后細(xì)胞活力正常。

1.4 吉非替尼對細(xì)胞抑制率的測定

消化離心正常生長的耐吉非替尼PC9/ZD細(xì)胞株，并調(diào)整細(xì)胞濃度為3×104個/mL，在96孔板中每孔加入100 μL細(xì)胞懸液（邊緣孔用無菌PBS填充）平均分為對照組和實(shí)驗(yàn)組，均加入用稀鹽酸溶解過濾后濃度為10 μg/mL的吉非替尼藥物溶液，調(diào)整每孔吉非替尼濃度分別為0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0 μg/mL，并在實(shí)驗(yàn)組的小孔中加入姜黃素（Cur），并調(diào)整每孔Cur含量為60 μmol/L。設(shè)置4個復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，每孔加入5 mg/mL MTT溶液20 μL；置于培養(yǎng)箱4 h后吸去上清液，每孔加DMSO 150 μL，振蕩3 min；采用全自動酶標(biāo)儀（美國Bio-Tex）檢測波長為490 nm的吸光度（OD值）。計(jì)算抑制率，公式為=（1-實(shí)驗(yàn)組/對照組）×100%。

1.5 transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲能力

①轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)：消化離心正常生長的耐吉非替尼PC9/ZD細(xì)胞株，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104個/mL，該組為對照組；向細(xì)胞懸液加入Cur，使Cur含量為60 μmol/L，細(xì)胞濃度也為5×104個/mL，該組為實(shí)驗(yàn)組；然后在每個transwell小室的上室中加入200 μL兩組細(xì)胞懸液，同時下室中加入含10%胎牛血清的DEME培養(yǎng)基500 μL；放置于培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24 h后小心吸去上下小室中的液體，并倒扣于濾紙上2 min；除去上室中未穿出的細(xì)胞；室溫固定15 min（4%多聚甲醛）；染色20 min（0.1%結(jié)晶紫染色液）；風(fēng)干后觀察、200倍鏡下拍照和計(jì)數(shù)（每個小室隨機(jī)選取5個視野）。設(shè)置3個復(fù)孔。②侵襲實(shí)驗(yàn)：先在每個transwell小室的上室加入事先4℃過夜解凍并用DEME培養(yǎng)基稀釋6倍的Matrigel膠60 μL。細(xì)胞懸液密度變?yōu)?×104，其余步驟同轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)。

1.6 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞蛋白表達(dá)

常規(guī)培養(yǎng)的PC9/ZD細(xì)胞為對照組。預(yù)用含Cur含量為60 μmol/L的培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h的PC9/ZD細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組。采用裂解液（PMSF∶RIPA=1∶100）提取細(xì)胞總蛋白。蛋白濃度是由RIPA裂解液調(diào)整為5 μg/μL，然后使蛋白高溫下變性。配制分離和濃縮膠濃度為5%和10%，然后用恒壓100 V進(jìn)行電泳1 h，待電泳結(jié)束后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜條件為冰浴、恒流2 h。封閉將轉(zhuǎn)膜后的PVDF膜在4℃過夜條件下進(jìn)行一抗處理。次日洗膜3次，進(jìn)行二抗處理，37℃、1 h。再次洗膜3次用ECL顯色后采用Quantity One軟件（Bio-Rad）進(jìn)行半定量比較分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，并進(jìn)行兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞株形態(tài)

倒置相差顯微鏡（OLYMPUS 200×）直接觀察人肺腺癌PC9細(xì)胞株和人肺腺癌耐吉非替尼PC9/ZD細(xì)胞株。在200倍鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，PC9細(xì)胞表現(xiàn)為上皮樣形態(tài)，細(xì)胞大小均勻，為立方形或圓形；而PC9/ZD細(xì)胞株表現(xiàn)為間質(zhì)樣形態(tài)，細(xì)胞大小不一，甚至為多邊形，細(xì)胞間距增大，并且有明顯的偽足（封三圖1）。

2.2 吉非替尼對兩組細(xì)胞的抑制率比較

吉非替尼對兩組細(xì)胞抑制效果見表1，并以吉非替尼濃度為橫坐標(biāo)，細(xì)胞抑制率為縱坐標(biāo)，繪制圖表（封三圖2）。結(jié)果顯示隨著吉非替尼濃度增加，吉非替尼對兩組細(xì)胞的抑制作用逐漸增強(qiáng)；并且在同樣藥物濃度作用下，實(shí)驗(yàn)組抑制率明顯高于對照組（除1.0 μg/mL）（P<0.05）。

2.3 對照組與實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)移能力和侵襲能力比較

轉(zhuǎn)移和侵襲實(shí)驗(yàn)中，對照組穿過小室細(xì)胞數(shù)分別為（103.67±13.67）和（59.89±8.19）。實(shí)驗(yàn)組穿過小室細(xì)胞數(shù)分別為（75.67±8.82）和（17.22±3.63），表明姜黃素可以明顯干擾人肺腺癌耐吉非替尼PC9/ZD細(xì)胞株轉(zhuǎn)移（t=2.77，P=0.011）和侵襲能力（t=2.41，P=0.016），見封三圖3。

2.4 兩組EMT相關(guān)蛋白表達(dá)及PI3K/AKT/mTOR信號通路p-AKT、p-mTOR比較

Western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組比較[蛋白相對含量E-cadherin和Vimentin分別為（0.29±0.11）和（1.28±0.28）]，實(shí)驗(yàn)組的E-cadherin表達(dá)上調(diào)[蛋白相對含量為（0.82±0.27）]，Vimentin表達(dá)下調(diào)[蛋白相對含量為（1.07±0.23）]（圖1），表明姜黃素干預(yù)上皮間質(zhì)化的過程，使得上皮標(biāo)志蛋白表達(dá)上調(diào)，間質(zhì)標(biāo)志蛋白表達(dá)下調(diào)。另一方面，相比于對照組[蛋白相對含量p-AKT和p-mTOR分別為（0.63±0.17）和（1.10±0.19）]，實(shí)驗(yàn)組的p-AKT[蛋白相對含量為（0.20±0.05）]、p-mTOR[蛋白相對含量為（0.72±0.25）]也呈現(xiàn)低表達(dá)的狀態(tài)（圖2），說明姜黃素阻斷PI3K/AKT/mTOR 信號通路，進(jìn)而改變上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的過程。

3討論

肺腺癌的治療是一個多學(xué)科綜合治療的過程，包括手術(shù)、化療和靶向治療等。吉非替尼作為治療肺腺癌的臨床一線化療藥物應(yīng)用十分廣泛，主要從三個方面發(fā)揮藥理作用：①競爭EGFR-TK催化區(qū)域上Mg-ATP結(jié)合位點(diǎn)，阻斷其信號傳遞；②抑制有絲分裂原活化蛋白激酶的活化，促進(jìn)細(xì)胞凋亡；③抑制腫瘤血管[5]。但臨床上常發(fā)生腫瘤細(xì)胞對其產(chǎn)生耐藥的現(xiàn)象從而導(dǎo)致化療失敗和預(yù)后不良[6]。腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥（MDR）可分為原發(fā)性耐藥和獲得性耐藥兩種類型[7]。

目前，普遍認(rèn)為肺腺癌的轉(zhuǎn)移和侵襲過程以及獲得耐藥能力的過程中均可能與EMT有關(guān)。李優(yōu)等[8]研究表明，通過干預(yù)PI3K/AKT/mTOR信號通路可以使EMT相關(guān)的E-鈣粘蛋白、波形蛋白表達(dá)發(fā)生改變，從而減弱經(jīng)TGF-β1誘導(dǎo)的肺腺癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力。腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化時，一些經(jīng)典的信號傳導(dǎo)通路已經(jīng)被證實(shí)，如HGF/c-Met信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、轉(zhuǎn)錄因子Snail家族、β-連環(huán)蛋白通路、β-連環(huán)蛋白與磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B途徑等[9-11]。此外還有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移侵襲與其發(fā)生EMT時腫瘤細(xì)胞的基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)上調(diào)、改變細(xì)胞微環(huán)境有關(guān)[12]。由此可見，通過干預(yù)腫瘤細(xì)胞EMT的發(fā)生能夠成為治療癌癥的新方向。

姜黃素可以通過多種途徑干預(yù)腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為，如 Wnt/β-catenin 信號傳導(dǎo)通路、PI3K/AKT/mTOR信號通路、細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB） 和STAT-3 信號通路等[8，13，14]。龐慧芳等[15]通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)姜黃素能夠逆轉(zhuǎn)TGF-β1誘導(dǎo)的胰腺癌 PANC-1 細(xì)胞的EMT過程，降低胰腺癌的惡性程度從而達(dá)到治療的目的。姜黃素的抗腫瘤作用越來越被重視。美國國立癌癥研究所已經(jīng)將其列為第三代抗癌預(yù)防藥，因?yàn)槠渲委熜Ч@著、不良反應(yīng)少、安全性高等特點(diǎn)，在日本廣泛應(yīng)用[16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相比于親代耐藥細(xì)胞，經(jīng)姜黃素處理的耐吉非替尼肺腺癌細(xì)胞對吉非替尼的敏感性明顯改善；轉(zhuǎn)移和侵襲能力也相應(yīng)地減弱；上皮間質(zhì)化標(biāo)志蛋白Vimentin表達(dá)下調(diào)，E-cadherin表達(dá)上調(diào)。上述結(jié)果均說明姜黃素對耐吉非替尼肺腺癌生物學(xué)行為的改變甚至逆轉(zhuǎn)上皮間質(zhì)化的過程。

在腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程中，PI3K/AKT/mTOR信號傳導(dǎo)通路扮演著重要角色[17]。在多種惡性腫瘤細(xì)胞中均能發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT/mTOR信號傳導(dǎo)通路處于異常激活狀態(tài)，與惡性腫瘤的各種生物學(xué)行為密切相關(guān)[18]。因此，針對該信號通路的研究和靶向藥物的應(yīng)用成為熱點(diǎn)。有研究發(fā)現(xiàn)可以通過使PI3K/AKT/ARK5信號通路處于活化狀態(tài)促進(jìn)Snail蛋白進(jìn)細(xì)胞核從而使細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)化[19，20]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相比于親代耐藥細(xì)胞，姜黃素改變耐吉非替尼肺腺癌細(xì)胞的AKT、mTOR蛋白磷酸化。上述結(jié)果同時與Vimentin表達(dá)下調(diào)、E-cadherin表達(dá)上調(diào)相吻合，共同說明經(jīng)姜黃素處理后，耐吉非替尼肺腺癌上皮間質(zhì)化的過程被阻斷甚至逆轉(zhuǎn)。

結(jié)合國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示姜黃素對耐吉非替尼肺腺癌上皮間質(zhì)化有明顯作用，為下一步實(shí)驗(yàn)提供了理論基礎(chǔ)，進(jìn)一步研究分子機(jī)制，通過基因檢測等其他手段明確姜黃素藥理作用與EMT的內(nèi)在聯(lián)系，為逆轉(zhuǎn)EMT以及抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展提供新的證據(jù)。

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（收稿日期：2016-07-09）