王 曼,張錫林,黃玉清,陳文碧,佘俊萍,向 麗,王光西

斯氏貍殖吸蟲(Paragonimusskrjabini)主要分布于四川、云南、貴州、湖北、福建等14個省、市、自治區(qū)，人是本蟲的非適宜宿主，蟲體在人體內(nèi)不發(fā)育為成蟲，而是以幼蟲狀態(tài)到處游竄，引起幼蟲移行癥。主要表現(xiàn)是游走性皮下結(jié)節(jié)，但幼蟲也可侵入肝、腦等組織中，容易造成臨床誤診。其中，腦型并殖吸蟲病對中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷較大[1]。線粒體作為生物體呼吸代謝的主要細胞器，其基因組具有結(jié)構(gòu)簡單、母系遺傳、缺少重組、進化速率快等特點，目前已成為研究吸蟲代謝途徑、研究抗蟲藥物的理想靶標[2-3]。有研究顯示，mtDNA-Cytb(線粒體DNA-細胞色素b)序列分析可以用于帶絳蟲生物多態(tài)性研究[4]。斯氏貍殖吸蟲移行過程中要穿過不同組織，需要不同的酶及大量能量，這與蟲體線粒體基因轉(zhuǎn)錄水平有無關(guān)系？蟲體不同發(fā)育階段線粒體基因轉(zhuǎn)錄是否有差別？為此，本實驗采用RT-PCR，T/A克隆及RTQ-PCR技術(shù)，研究斯氏貍殖吸蟲線粒體Cytb(cytochrome B)基因在不同蟲期的轉(zhuǎn)錄，為更深入了解該吸蟲的物質(zhì)代謝途徑，探索藥物作用的藥靶奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1實驗材料及儀器

1.1.1囊蚴和蟲體的獲取 自云南威信縣肺吸蟲病流行區(qū)采集溪蟹，從溪蟹中分離出囊蚴，經(jīng)過形態(tài)學(xué)鑒定為斯氏貍殖吸蟲囊蚴[5]。采用腹腔注射法，感染雄性家犬(由瀘州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供)(200個囊蚴/條)1條，感染雄性SD大鼠(由瀘州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供)20只(30±2個囊蚴/只)。(感染前，取犬、大鼠糞便檢查寄生蟲卵陰性)。鏡下觀測囊蚴結(jié)構(gòu)、形態(tài)，初步鑒定為斯氏貍殖吸蟲囊蚴。

感染第30 d麻醉處死大鼠10只，在肝臟及腹腔檢獲斯氏貍殖吸蟲幼蟲。感染第60 d麻醉處死10只大鼠，在肝臟和肺部檢獲斯氏貍殖吸蟲童蟲。感染第90 d麻醉處死家犬，在肺部檢獲斯氏貍殖吸蟲成蟲。將部分成蟲置生理鹽水培養(yǎng)過夜，收集培養(yǎng)液離心獲蟲卵。成蟲經(jīng)卡紅染色后觀察其內(nèi)部的形態(tài)結(jié)構(gòu)，鑒定為斯氏貍殖吸蟲。

1.1.2主要試劑 Trizol (美國Invitrogen公司)；RT-PCR試劑盒、Ex Taq酶、DNA Marker DL-2000(日本TaKaRa公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(寶生物工程(大連)有限公司)；E.Z.N.A. Cycle-Pure Kit(美國Omega公司)、E.Z.N.A. Gel Extract Kit(美國Omega公司) 、E.Z.N.A. Plasmid Miniprep Kit (美國Omega公司)；瓊脂糖 (西班牙Biowest公司)；無水乙醇 、三氯甲烷、異丙醇(成都市科龍化學(xué)試劑廠)；溴酚藍 (上海生工生物技術(shù)有限公司)。

1.1.3主要儀器 PCR儀 (美國Bio-Rad公司170-9703型)；瓊脂糖凝膠電泳裝置 (美國Bio-Rad公司)；RTQ-PCR儀 (美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司ABI 7500型)；凝膠成像掃描儀 (美國Bio-Rad公司Universal Hood Ⅱ型)；凝膠成像結(jié)果分析軟件Quantity One(美國Bio-Rad公司)；低溫高速離心機 (美國Beckman公司Avanti-J-25型)；小型離心機 (美國Sigma公司1-1S型)；紫外分光光度計 (美國Beckman公司，DU-640型)；微型漩渦混合儀(上海滬西分析儀器廠有限公司W(wǎng)H-2型)；核酸蛋白檢測儀(上海滬西分析儀器廠 HD-2)。

1.2方法

1.2.1總RNA的提取 囊蚴、幼蟲、童蟲、成蟲及蟲卵5個蟲期總RNA的提取方法相同。分別用0.01 mol/L PBS(pH 7.2)洗滌3次，備用。

取50～100 mg蟲體在勻漿器中，用無菌DEPC水吹洗兩遍，然后加入1 mL Trizol，吹打兩次，研磨勻漿，直至看不見明顯的固體(整個過程均在冰上完成)。室溫靜置5 min后，將勻漿過后的溶液移入1.5 mL EP管中，并加入0.2 mL氯仿，蓋緊樣品管蓋，用力搖晃EP管15 s并將其室溫下靜置2～3 min，然后4 ℃12 000×g離心15 min，小心提取上層無色水相(RNA溶于此)至另一1.5 mL EP管中，加入等體積、預(yù)冷的異丙醇，輕柔混勻，室溫靜置5～10 min，然后4 ℃ 12 000×g離心10 min，棄上清，下部白色沉淀為總RNA。加預(yù)冷75%乙醇1 mL洗滌RNA，4 ℃7 500×g離心5 min，棄上清，晾干，加入20 μL無菌水溶解沉淀。NaroDrop 1000紫外分光光度儀測RNA 濃度。

1.2.2cDNA的合成 按照寶生物工程(大連)有限公司高效率逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 ReverTra Ace -α-cDNA 合成cDNA。反應(yīng)條件： 5×primescript Buffer 2 μL,Primescript RT Enzyme Mix1 0.5 μL, Oligo dT primer 0.5 μL, Total RNA 500 ng(10 μL反應(yīng)體系最大值), Random 6 mers 0.5 μL, 加DEPC水至總體積 10 μL。反應(yīng)程序：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。 NaroDrop 1000紫外分光光度儀檢測cDNA質(zhì)量。

1.2.3各個蟲期cDNA 的PCR擴增 根據(jù)斯氏貍殖吸蟲線粒體cytb基因片段設(shè)計了一對特異引物:

CytbF: 5′-GGTTGCTTGATCATAACATTGG -3′

CytbR: 5′-GACACTCTGGGTCGACCTTG-3′

25 μL的反應(yīng)體系：TaKaRa Ex Taq(5 U/μL) 0.5 μL、10×Ex Taq Buffer(Mg2+Free) 2.5 μL、MgCl2(25 mmol/L) 2 μL、dNTP Mixture(各2.5 mmol/L) 2 μL、滅菌dd H2O15 μL、引物CytbF 1 μL、引物CytbR 1 μL、模板1 μL。PCR擴增條件為：94 ℃預(yù)變性5 min，1個循環(huán)；然后94 ℃變性1 min，48 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.4Realtime PCR測定及熔解曲線分析 引物由上海賽百盛公司設(shè)計并合成。內(nèi)參引物：根據(jù)吸蟲18S rDNA V4區(qū)設(shè)計。

內(nèi)參引物：

5′-TGGTTGATCCTGCCAGATGTCATATGCTTG -3′

5′-GTCCTTGGATGTGGTAGCCATTTCTCAGGC -3′

特異引物：

5′- GGTTGCTTGATCATAACATTGG -3′

5′- GACACTCTGGGTCGACCTTG -3′

取5個蟲期cDNA進行SYBR Green I熒光定量PCR，按照TOYOBO反應(yīng)試劑盒進行：2×SYBR 10 μL，上、下游引物各0.8 μL，模板2 μL，無菌水6.4 μL，總體積20 μL。反應(yīng)程序為：95 ℃ 1 min;95 ℃ 15 s、60 ℃ 15 s、70 ℃ 42 s ，40個循環(huán)。循環(huán)結(jié)束后進行熔解曲線分析。將目的基因質(zhì)粒作為標準品，進行10倍梯度稀釋同時進行定量PCR，將各個標準品的起始拷貝數(shù)取對數(shù)，作為橫坐標，其所對應(yīng)的Ct值作為縱坐標，即得到標準曲線，用數(shù)據(jù)分析軟件將樣本的擴增曲線與標準曲線對比,并結(jié)合內(nèi)參自動計算出各目的基因的拷貝數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1蟲種鑒定 通過對囊蚴、成蟲蟲體的形態(tài)觀察鑒定為斯氏貍殖吸蟲(見圖1)。

2.25個蟲期 RNA、cDNA濃度值 囊蚴、30 d幼蟲、60 d童蟲、成蟲、蟲卵RNA濃度值分別為：150.9 ng/μL、164.3 ng/μL、401.8 ng/μL、305.4 ng/μL、690.2 ng/μL，cDNA濃度值分別為：1 413.2 ng/μL、2 264.8 ng/μL、2 063.2 ng/μL、3 407.6 ng/μL、1 367.3 ng/μL。

2.35個蟲期cDNA的PCR擴增結(jié)果 斯氏貍殖吸蟲線粒體Cytb(目的片段542 bp)除了在蟲卵期無轉(zhuǎn)錄，其他4個蟲期均有轉(zhuǎn)錄(見圖2)。

圖1 斯氏貍殖吸蟲囊蚴、成蟲形態(tài)

圖2 斯氏貍殖吸蟲5個蟲期cDNA的PCR擴增結(jié)果電泳圖

2.4Real-time PCR 標準曲線 標準曲線線性關(guān)系良好(圖3)，回歸系數(shù)γ=0.994，定量結(jié)果準確可靠。

2.5Real-time PCR 熔解曲線 熔解曲線背景干凈，所有曲線只有一個主峰并且在相同的溫度之間，說明引物的特異性高，擴增產(chǎn)物單一特異(圖4)。

2.6Real-time PCR 目的基因擴增曲線 擴增曲線平滑，每條曲線均有明顯的指數(shù)擴增期，基線平、無上揚，不同的標準起始模板數(shù)在反應(yīng)后的平臺期，產(chǎn)物量相差不大。曲線與曲線間平行性較好，說明各反應(yīng)管擴增效率相近，定量的重復(fù)性和準確性較好(圖5)。

RTQ-PCR儀器自帶軟件顯示目標樣本的基因轉(zhuǎn)錄水平, 線粒體Cytb轉(zhuǎn)錄主要在囊蚴期、幼蟲期及童蟲期，并且是逐步升高趨勢，成蟲期轉(zhuǎn)錄較少，蟲卵期沒有轉(zhuǎn)錄。各期的轉(zhuǎn)錄量：蟲卵期為0，囊蚴期34.34±0.26，30 d幼蟲期42.56±0.35，60 d童蟲期46.12±0.56，成蟲期17.64±0.77(圖6)。

圖3 斯氏貍殖吸蟲線粒體Cytb基因標準曲線

圖4 斯氏貍殖吸蟲線粒體Cytb gene熔解曲線

圖5 斯氏貍殖吸蟲線粒體Cytb基因擴增曲線

3 討 論

在我國斯氏貍殖吸蟲分布較廣，危害嚴重，如：廣州北部山區(qū)新發(fā)現(xiàn)衛(wèi)氏并殖吸蟲超高度疫源地兩處，斯氏貍殖吸蟲中度疫源地一處，呂田地區(qū)擬釘螺螺尾蚴感染率0.03%(1/310)，溪蟹囊蚴感染率36.73%(36/98)，感染度4.55個囊蚴/只蟹，0.53個囊蚴/g蟹，蟹種為平遠南海溪蟹[6]。據(jù)調(diào)查神農(nóng)架林區(qū)第一中間宿主螺的感染率為0.91%，第二中間宿主淡水蟹感染囊蚴為3.21個/只，動物宿主貓和果子貍的自然感染率為51.72%和15.79%，且斯氏貍殖吸蟲病人群血清抗體陽性率為6.74%(76/1128)[7]，三峽庫區(qū)淡水蟹斯氏貍殖吸蟲囊蚴的感染率為39.65%，斯氏貍殖吸蟲病人群血清抗體陽性率為7.46%(54/724)[8]，云南威信扎西地區(qū)淡水蟹斯氏貍殖吸蟲囊蚴的感染率為33.8%(43/130)[9]，由此可見，斯氏貍殖吸蟲病隨時可能在人群中暴發(fā)。全球已報道的并殖吸蟲有50多種，其中中國報道35種，但有許多是同物異名，崔愛利等學(xué)者應(yīng)用PCR技術(shù)擴增了斯氏貍殖吸蟲的ITS2和部分COI基因，分析了序列的同源性，并構(gòu)建種系發(fā)生樹，從分子生物學(xué)角度揭示了四川并殖吸蟲與斯氏貍殖吸蟲系同種異名，泡囊并殖吸蟲與日本的宮崎并殖吸蟲也是斯氏貍殖吸蟲的同種異名的推論[10]。

圖6 斯氏貍殖吸蟲各個發(fā)育階段的線粒體Cytb 基因mRNA相對轉(zhuǎn)錄水平

由于人是斯氏貍殖吸蟲的的非適宜宿主，蟲體以幼蟲狀態(tài)引起宿主幼蟲移行癥，但是，其致病的機制一直未能完全闡明，給此病的診斷和治療造成了一些困難，為此本研究從線粒體Cytb基因的角度來研究斯氏貍殖吸蟲的致病機制，并發(fā)現(xiàn)了斯氏貍殖吸蟲線粒體Cytb基因除了在蟲卵期不轉(zhuǎn)錄以外，其他4個蟲期均有轉(zhuǎn)錄,從囊蚴期、30 d幼蟲期、60 d童蟲期，Cytb基因轉(zhuǎn)錄逐步升高，在60 d童蟲期高表達，提示該基因在幼蟲的發(fā)育和移行中有重要作用。也證明了囊蚴經(jīng)口感染，在消化液作用下，后尾蚴脫囊而出，幼蟲穿過腸壁進入腹腔，移行、串擾，串致肝臟，穿過膈肌經(jīng)胸腔致肺臟發(fā)育成蟲定居，在這4個蟲期斯氏貍殖吸蟲一直不停的在進行發(fā)育、組織遷移并逃避宿主的免疫，具有很強侵襲作用，利用線粒體Cytb基因能否應(yīng)用在藥物靶點中還有待進一步的研究證實。

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