楊 玲，焦 倩，曾文鋌，梁增偉，謝栩碩

我國是乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染高流行區(qū)，一般人群乙肝表面抗原(HBsAg)流行率為7.18%[1]。慢性乙型肝炎患者可因多種因素出現(xiàn)肝臟炎癥活動，大部分肝炎活動預后良好，但嚴重的肝炎活動可進展為肝衰竭；肝衰竭來勢兇險，進展迅速，病死率高。目前肝衰竭預警預測和確定病情的評估指標尚不完善，存在一定的缺陷。本研究分析慢性乙型肝炎患者中出現(xiàn)肝炎活動的病例，探討影響嚴重肝炎活動預后的因素，篩選出預測進展為肝衰竭的臨床和病毒學指標。

1 對象與方法

1.1研究對象 連續(xù)收集南方醫(yī)院及廣州醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院于2008年1月至2009年6月住院治療的嚴重肝炎活動患者。嚴重肝炎活動定義為文獻報道[3]：慢性乙型病毒性肝炎基礎上，本次發(fā)病時血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT) ≥ 600 U/L，總膽紅素(TB) ≥51.3 μmol/L及40% <凝血酶原時間活動度(PTA)≤50%[2]。排除標準：合并其他肝炎病毒及人類免疫缺陷病毒感染；肝硬化；肝癌；嚴重代謝性肝病或自身免疫性肝病者；藥物性肝炎；長期免疫抑制劑治療者，包括器官移植后患者；妊娠。另外排除化療藥物或免疫抑制劑使用導致的肝炎活動，排除核苷類似物停藥導致的肝炎活動。

嚴重肝炎活動進展為肝衰竭的診斷標準，參照2006年我國的《肝衰竭診療指南》[3]：出現(xiàn)以下表現(xiàn)者：①極度乏力，有明顯的消化道癥狀。②黃疸迅速加深，TB ≥正常值上限10倍或每日上升≥17.1 μmol/L。③PTA≤40%并排除其他原因者。

收集患者的臨床指標：包括ALT、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、TB、PTA、白蛋白(ALB)、白細胞(WBC)、血小板(PLT)、肌酐(Cr)和HBV DNA定量。收集血清，鑒定BCP(A1762T/G1764A)變異、PC(G1896A)變異及HBV基因型。

1.2HBV BCP和PC變異檢測 擴增方法如下：取HBV DNA 2 μL，用引物Is2-2(5′-CATGGAGACCAC CGT GAACGC-3′)和P35(5′-TGATAAGATAGGGGCATTTG-3′)擴增HBV PreC/C區(qū)。反應總體積為20 μL；擴增條件為94 ℃預變性1 min；然后94 ℃變性25 s，55 ℃退火25 s，72 ℃延伸50 s，共循環(huán)35圈；最后72 ℃再延伸5 min。取第1輪PCR產(chǎn)物2 μL，用引物P9和P35進行半巢式PCR擴增。反應總體積為20 μL；擴增條件為94 ℃預變性1 min；然后94 ℃變性20 s，55 ℃退火25 s，72 ℃ 延伸40 s，共循環(huán)35圈；最后72 ℃再延伸5 min。取第2輪PCR產(chǎn)物3 μL，用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳，紫外燈下觀察。序列測定取擴增成功且產(chǎn)物帶明顯的樣本以引物Is2-2送測序。對于擴增陰性的標本，換用引物P1(5′-TTTTTCACCTCTGCCTAATCA-3′)和P35進行第1輪擴增，用P1和HC24R(5′-CCTGAGTGCTGTATGGTGAGG-3′)進行半巢式第2輪擴增。測序工作由廣州英駿公司完成，測序儀為ABI 3730。

1.3HBV基因分型鑒定 用PCR限制性片段長度酶切法(PCR-RFLP)按文獻所述進行[8]。取抽提的DNA3 μL, 先用1 對外引物BS1 (5′-CCTG CTGGTGGCTCCAGTTCC-3′)和Pol2 (5′-CGGGCAACGGG GTAAAGGTTC-3′)進行第一 輪PCR 擴增；再用1 對內(nèi)引物YS1(5′- GCGGGGTTTTTCTT GTT GA-3′)和YS2 (5′-GGGACTCAAGATGTTGTACA-3′)進行第2輪PCR擴增。PCR 產(chǎn)物分別用內(nèi)切酶StyI和BsrSI進行酶切。兩種酶切產(chǎn)物同時在2.5%的瓊脂糖凝膠上進行電泳，紫外燈下觀察PCR產(chǎn)物酶切情況，根據(jù)圖譜分型：如果BsrSI可切的，StyI不可切，為B；如果BsrSI不可切的，StyI可切，為C；均切動或均切不動取擴增產(chǎn)物送測序。

1.4統(tǒng)計方法 統(tǒng)計學分析采用SPSS 13.0 軟件。運用Logistic回歸單因素分析各研究變量與研究結果的關系，并計算優(yōu)勢比(OR)及95%可信區(qū)間(CI)。單因素分析有顯著統(tǒng)計學意義的變量進行二分類Logistic分析，篩選出相關的危險因素。P<0.05 為有統(tǒng)計學差異。

2 結 果

2.1嚴重肝炎活動患者的臨床及病毒學資料 調(diào)查69例嚴重肝炎活動的患者，其中62例患者既往未接受或不規(guī)范短期使用核苷類似物治療，此次使用拉米夫定(LMD)或恩替卡韋(ETV)治療，7例患者既往曾使用LMD耐藥，此次加用阿德福韋酯(ADV)或代丁治療。治療中以內(nèi)科治療為主，均未進行肝移植；其中有3例患者進行了2～3次血漿替換治療，1例存活，2例死亡；1例患者在病程早期應用2天甲強龍沖擊治療。69例患者中，63例男性，6例女性；年齡33歲(20-54) [中位數(shù)(最小值-最大值)]。發(fā)病時臨床資料為：ALT 343 IU/L (18～2481)，AST 207 IU/L (41～1359)，ALB 33 g/dL (25.2～43.6)，TB 224 μmol/dL (39.2～704.0)，PTA 40.5%(8～138)，Cr74 μmol/dL (49～436)，PLT計數(shù) 160×1012/L (42～348)，WBC計數(shù) 6.2×109L-1(2.3～13.4)，HBV DNA定量5.4lg copies/mL (3.00～9.11)。40例(40/69, 58%)患者為HBeAg陰性?；蛐鸵訠型和C型多見，其中以基因B型為主(46/65, 70.8%)；有2例患者為基因D型。68例患者鑒定了PC(G1896A)變異，其中PC變異率為54.4%；52例患者鑒定了BCP(A1762T/G1764A)變異，BCP變異率為42.3%；其中9例患者同時發(fā)生BCP和PC變異。

2.2嚴重肝炎活動進展為肝衰竭的預測因素 通過Logistic回歸單因素和多因素分析與嚴重肝炎活動進展成肝衰竭相關的指標(表1)。單因素分析顯示TB>256 μmol/dL、PTA<40%與嚴重肝炎活動進展為肝衰竭相關。單因素分析中有統(tǒng)計學意義的指標TB及PTA納入多因素分析，通過多因素分析顯示：T >256 μmol/dL (P=0.008)、PTA <40%(P<0.001) 是嚴重肝炎活動進展為肝衰竭的危險因素。而與進展為肝衰竭相關的其他指標中，HBeAg陰性的優(yōu)勢指數(shù)OR為4 826.370，P=0.065；PC變異的優(yōu)勢指數(shù)OR=0.033，P=0.090。

表1 嚴重肝炎活動進展成肝衰竭相關的因素分析

2.3嚴重肝炎活動患者與結局相關的因素 在69例嚴重肝炎活動的患者中，有33例(47.8%)患者進展為肝衰竭，均未實施肝移植，有15例(21.7%)患者在住院期間或隨訪3個月后死亡。分析與預后相關的指標見表2。單因素分析顯示與嚴重肝炎活動預后不良相關的指標包括：TB>256 μmol/dL，PTA<20%。多因素分析顯示PTA <20%(P=0.006)是嚴重肝炎活動患者死亡的危險因素。嚴重肝炎活動患者中PTA<20%的患者共11例，臨床及病毒學資料見表3。發(fā)病時臨床資料為：ALT 601 IU/l (50～1 482)，TB 452 μmol/dL (122.7～591.9)，ALB 30.9 g/dL (25.4～37.1)?；駼型為主(8/11)，6例(6/11)患者為HBeAg陰性。6例(6/11)患者發(fā)生PC(G1896A)變異，6例(6/9)發(fā)生BCP變異，其中3例患者同時發(fā)生BCP和PC變異。9例(9/11)患者死亡。

3 討 論

每年有超過30%的慢性乙型肝炎患者出現(xiàn)肝炎活動[4]，其中部分嚴重肝炎活動進展為肝衰竭；評估嚴重肝炎活動進展成肝衰竭的風險對于早期治療和干預非常重要。本研究通過調(diào)查由嚴重肝炎活動快速進展為肝衰竭的臨床和病毒學指標，篩選預測進展為肝衰竭的指標。研究中所收集的嚴重肝炎活動的病例，根據(jù)臨床指標顯示TB中位數(shù)224 μmol/dL、PTA中位數(shù)40.5%，提示患者的病情均較重，因此進展成肝衰竭的風險高，這與以往的研究中選擇慢性乙型肝炎患者作為對照不同，所以能更好的提供進展成肝衰竭的預測因素。

在嚴重肝炎活動進展為肝衰竭的指標中，多因素分析顯示TB>256 μmol/dL、PTA<40%是嚴重肝炎活動預后不良的因素，與進展為肝衰竭相關。日本Yoshiba[5]篩選出的早期診斷肝衰竭的判別公式中，同樣也顯示TB的水平與肝衰竭的發(fā)生率呈正相關。本研究進一步篩選與嚴重肝炎活動預后相關的指標，顯示凝血功能的進一步惡化(PTA<20%)與患者的死亡相關。而作為評價終末期肝病存活率的MELD評分中[6-7]也包含反應凝血功能的指標：國際標準化比率(INR)。根據(jù)2008年亞太肝病學會慢加急性肝功能衰竭專家組意見將血清總膽紅素(TB≥85 μmol/dL)及凝血障礙(PTA<40%)作為診斷肝衰竭的必要條件[8]；故血清TB及PTA可作為臨床上判斷嚴重肝炎活動患者病情及預后的重要指標。

表2 嚴重肝炎活動患者與預后相關的因素分析

表3 嚴重肝炎活動患者中PTA<20%的患者資料

在嚴重肝炎活動發(fā)展為肝衰竭的其他預測指標中，HBeAg陰性(OR 4826.370,P=0.065)、PC變異(OR 0.033,P=0.090)表現(xiàn)與病情的惡化有一定相關性。在所調(diào)查的嚴重肝炎活動患者HBeAg陰性率高達58%；且發(fā)生PC變異的患者也明顯增多，PC變異率(37/68, 54.4%)與同期所收集的44例慢性乙型病毒性肝炎患者(8/44,18.2%)[9]比較有統(tǒng)計學差異(P<0.001)。且基因B型的比率也較同期收集的慢性乙型肝炎患者增高[70.8%(46/65) vs. 50%(22/44);P=0.002]，而基因B型更易發(fā)生PC變異[11]。PC發(fā)生變異后，在前C末端產(chǎn)生終止密碼子，使HBeAg不能合成，導致HBeAg陰性。HBeAg作為耐受原，通過使Th1輔助細胞耗竭來抑制Th1細胞發(fā)動CTL攻擊感染肝細胞的能力；而當HBeAg分泌的減少后，機體免疫耐受的狀態(tài)被打破，使受感染的肝細胞更容易受到攻擊；從而出現(xiàn)肝細胞壞死，臨床上表現(xiàn)為肝炎發(fā)作[10]，嚴重者進展成肝衰竭。

BCP變異未顯示與預后高的相關性(OR 0.986,P=0.989)，考慮在本研究中所調(diào)查的人群中基因C型的比例少19.2%(19/65)，而BCP變異更易發(fā)生在基因C型的患者中所致[11]。但調(diào)查顯示BCP變異率也高達42.3%，且在11例PTA<20%的患者共6例(6/9)發(fā)生BCP變異，所以在以后的研究中，通過擴大樣本量，可以能更好反映BCP變異與預后的關系。

綜上所述，由此顯示總膽紅素升高及凝血功能障礙在預測HBV相關的嚴重肝炎活動進展為肝衰竭中有顯著的意義。而HBeAg陰性引起免疫耐受被打破，機體免疫狀態(tài)發(fā)生改變，可能作為導致肝炎發(fā)作的原因之一。

參考文獻：

[1]Liang X, Bi S, Yang W, et al. Epidemiological serosurvey of hepatitis B in China--declining HBV prevalence due to hepatitis B vaccination[J]. Vaccine, 2009, 27(47): 6550-6557. DOI: 10.1016/j.vaccine.2009.08.048

[2]Ozasa A, Tanaka Y, Orito E, et al. Influence of genotypes and precore mutations on fulminant or chronic outcome of acute hepatitis B virus infection[J]. Hepatology, 2006, 44(2): 326-334.DOI:10.1002/hep.21249

[3]Liver Failure and Artificial Liver Group, Chinese Society of Infectious Diseases, Chinese Medical Association; Severe Liver Diseases and Artificial Liver Group, Chinese Society of Hepatology, Chinese Medical Association. Diagnostic and treatment guidelines for liver failure[J]. Chin J Hepatol, 2006, 14(9): 643-646. (in Chinese)

中華醫(yī)學會感染病學分會肝衰竭與人工肝學組,中華醫(yī)學會肝病學分會重型肝病與人工肝學組.肝衰竭診療指南[J].中華肝臟病雜志, 2006, 14(9): 643-646.

[4]Wong VW, Wong GL, Yiu KK, et al. Entecavir treatment in patients with severe acute exacerbation of chronic hepatitis B[J]. J Hepatol, 2011, 54(2): 236-242. DOI: 10.1016/j.jhep.2010.06.043

[5]Yoshiba M, Sekiyama K, Inoue K, et al. Accurate prediction of fulminant hepatic failure in severe acute viral hepatitis: multicenter study[J]. J Gastroenterol, 2002, 37(11): 916-921. DOI: 10.1016/S0022-5223(99)70472-1

[6]Kamath PS, Kim WR. The model for end-stage liver disease (MELD)[J]. Hepatology, 2007, 45(3): 797-805. DOI: 10.1002/hep.21563

[7]Tripodi A, Chantarangkul V, Primignani M, et al. The international normalized ratio calibrated for cirrhosis (INR(liver)) normalizes prothrombin time results for model for end-stage liver disease calculation[J]. Hepatology, 2007, 46(2): 520-527. DOI: 10.1002/hep.21732

[8]Satin SK, Kumar A, Almeida JA, et al. Acute-on-chronic liver failure: consensus recommendations of the Asian Pacific Association for the study of the liver (APASL)[J]. Hepatol Int, 2009, 3(1): 269-282. DOI: 10.1007/s12072-008-9106-x

[9]Yang L, Ma S, Hu X, et al. Presence of valine at position 27 of the hepatitis B virus core gene is associated with severe liver inflammation in Chinese patients[J]. J Med Virol, 2011, 83(2):218-224. DOI: 10.1002/jmv.21944.

[10]Hou J, Lin Y, Waters J, et al. Detection and significance of a G1862T variant of hepatitis B virus in Chinese patients with fulminant hepatitis[J]. J Gen Virol, 2002, 83(9): 2291-2298.

[11]Yuen MF, Sablon E, Yuan HJ, et al. Significance of hepatitis B genotype in acute exacerbation, HBeAg seroconversion, cirrhosis-related complications, and hepatocellular carcinoma[J]. Hepatology, 2003, 37(3): 562-567. DOI: 10.1053/jhep.2003.50098