張 濤,寧文艷,吳建華,劉京利,喬富貴,李貴昌,魯 亮,劉起勇,李 麗,趙建華

寧夏地處黃河中上游，跨東部季風和西北干旱區(qū)域，北部被騰格里沙漠、烏蘭布和沙漠、毛烏素沙漠地環(huán)繞，南部有黃土高原插入，地處我國三大自然區(qū)域的交會和過渡地帶。雖然是我國大陸面積最小的省份之一，但由于南部六盤山山脈和西北部賀蘭山山脈的存在，使其境內(nèi)具有豐富多樣的自然環(huán)境。從南往北，寧夏的生態(tài)環(huán)境涵蓋了西北地區(qū)所有的生態(tài)類型，有草原、森林、荒漠、濕地、農(nóng)田等截然不同的自然環(huán)境。在這多樣的生態(tài)環(huán)境中，形成了嚙齒動物種類的多樣性。寧夏記錄的嚙齒動物有38種，其中兔形目3種，嚙齒目35種[1]，僅倉鼠科就達16種。豐富的嚙齒動物種群，也造成寧夏具有多種鼠傳疾病的自然疫源地。寧夏東北部屬于內(nèi)蒙古高原長爪沙鼠鼠疫疫源地[2]，西南部的海原、西吉則屬于甘寧黃土高原阿拉善黃鼠鼠疫疫源地[3]，南部的六盤山南麓則存在姬鼠型的流行性出血熱自然疫源地[4]。同時寧夏中部和南部還是包蟲病的流行區(qū)[5]，鼠類在包蟲病原的保存和傳播中起到了非常重要的作用。

因此，嚙齒動物的準確分類和科學(xué)防治是寧夏多種重要傳染病預(yù)防和控制的關(guān)鍵。為了提高寧夏各級專業(yè)人員嚙齒動物分類鑒定水平，我們在寧夏各地采集嚙齒動物標本，并獲得了這些標本的DNA條形碼，一方面可以更準確的對這些嚙齒動物進行分類，也為以后利用DNA條形碼技術(shù)對嚙齒動物進行鑒定提供基礎(chǔ)資料。

1 材料和方法

1.1標本采集 2013年分別在寧夏賀蘭山、銀川月牙湖、靈武、海原、西吉、鹽池和涇源等地的不同生境采集嚙齒動物標本154份。經(jīng)外部形態(tài)鑒定有19種(詳見表1)。

表1 嚙齒動物形態(tài)鑒定結(jié)果及采集地區(qū)信息

1.2DNA提取 使用QIAGEN DNeasy Blood & Tissue Kit試劑盒提取肝臟或肌肉總DNA，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3PCR擴增與測序 擴增時首先選用下列通用引物[6]擴增線粒體COI基因片段。當通用引物擴增反應(yīng)失敗時，則選用Ivanova等[7]設(shè)計的雞尾酒引物(引物序列見表2)。PCR 反應(yīng)擴增體系：10×緩沖液2.5 μL，dNTP 0.5 μL，引物各0.5 μL，LA Taq酶0.15 μL，模板DNA 1 μL，加ddH2O至25 μL。PCR 反應(yīng)條件為: 95 ℃預(yù)變性5 min， 95 ℃變性45 s， 54 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35 個循環(huán)，最后再72 ℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，送測序公司進行雙向測序。

表2 PCR擴增COI基因的相關(guān)引物序列

1.4DNA序列分析 首先用DNAstar中的Seqman進行序列拼接。然后用Clustal W[7]軟件進行多重序列比對，并進行適當?shù)氖止ふ{(diào)整。同時將測定的序列在NCBI網(wǎng)站上運行BLAST[8]程序進行序列同源性比較，以確保所獲得的序列是目標序列。同時將BLAST結(jié)果中相似度大于95%的，或相似度最大的近緣種的序列也用于系統(tǒng)樹構(gòu)建，用于判斷形態(tài)鑒定的準確性。

1.5構(gòu)建系統(tǒng)樹 運用Mega5[9]軟件分析各基因序列的堿基組成和變異，基于Kimura-2-parameter(K2P)[10]模型的遺傳距離。采用鄰接法構(gòu)建全部COI基因序列的Neighbor Joining樹。

2 結(jié) 果

154份現(xiàn)場采集的標本中，通過通用引物和雞尾酒引物共擴增得到129條序列，成功率為84%。擴增片段的長度符合引物設(shè)計的預(yù)期，并經(jīng)過BLAST比對后確認為線粒體COI基因片段。

將這些片段排列整齊后構(gòu)建Neighbor-Joint 樹，形成20個具有高支持度的分支(不包括達烏爾黃鼠)，提示這些個體由20個有效的種類構(gòu)成(圖1)，和形態(tài)學(xué)鑒定的種類數(shù)量基本一致。從鹽池縣采集的1只黑線倉鼠和從靈武市采集1只黑線倉鼠形成了兩個分支，其中鹽池縣的黑線倉鼠與GenBank中的中國倉鼠(Cricetulusgriseus)的相應(yīng)序列具有99%的相似性，因此被修訂為中國倉鼠，而在GenBank中沒有與靈武市黑線倉鼠的COI序列相似的序列，我們還是以黑線倉鼠命名。與賀蘭山鼠兔相似度最高的是褐斑鼠兔(Ochotonapallasi)，相似度為96%。與阿拉善黃鼠相似度最高的是達烏爾黃鼠，相似度為92%。與長爪沙鼠相似度最高的是子午沙鼠，相似度只有88%，說明GenBank中沒有長爪沙鼠的相關(guān)序列。其他種類個體的BLAST結(jié)果都與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果一致，證明形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果是基本準確的。

在所有確定為一個鼠種的分支中，除了花鼠的分支內(nèi)遺傳距離較大外(7.5%)，其他分支內(nèi)遺傳距離最大為三趾跳鼠分支的3.2%。中國倉鼠與黑線倉鼠的分支間遺傳距離11.6，賀蘭山鼠兔與褐斑鼠兔間遺傳距離為3.6%(詳見圖1)。

圖1 寧夏不同地區(qū)嚙齒動物COI基因序列Neighbor Joining樹

3 討 論

本次調(diào)查比較系統(tǒng)地采集了寧夏南部六盤山、賀蘭山、東部草原、半荒漠草原和黃土高原(南華山和月亮山)地區(qū)的常見鼠種，而沙漠地區(qū)稀有鼠種都沒有捕獲，有待以后進一步進行調(diào)查。

寧夏存在兩種不同類型鼠疫自然疫源地，寧夏南部黃土高原的阿拉善黃鼠鼠疫自然疫源地和東部荒漠草原的長爪沙鼠自然疫源地。黃鼠在寧夏廣泛分布，一般將東部荒漠草原捕獲的黃鼠定名為達烏爾黃鼠，南部黃土高原捕獲的黃鼠定名為阿拉善黃鼠。在寧夏鼠疫疫源地宿主動物監(jiān)測中，常常面臨阿拉善黃鼠與達烏爾黃鼠的分類鑒定問題?；谛螒B(tài)特征的分類方法無法準確區(qū)分阿拉善黃鼠和達烏爾黃鼠，因而，阿拉善黃鼠長期以來一直被定為達烏爾黃鼠的一個亞種。但通過染色體核型的研究，逐漸發(fā)現(xiàn)典型的達烏爾黃鼠和一些阿拉善黃鼠存在染色體數(shù)量的差異，因此現(xiàn)在認為達烏爾黃鼠的二倍體染色體2n=36，而阿拉善黃鼠的二倍體染色體2n=38[11]。本研究首次在阿拉善黃鼠鼠疫疫源地分析了當?shù)攸S鼠的DNA條形碼序列，并與GenBank中達烏爾黃鼠的DNA條形碼進行了比對和系統(tǒng)關(guān)系分析，確定兩者之DNA條形碼的遺傳距離達到8%，達到了DNA條形碼公認的種間的遺傳距離。因此，從分子遺傳學(xué)的角度證明了阿拉善黃鼠和達烏爾黃鼠是兩個獨立種的關(guān)系。下一步需要進一步確認這兩種黃鼠的分布界限問題。阿拉善黃鼠的分布范圍是否就是原來達烏爾黃鼠阿拉善亞種的分布范圍還需要通過大量標本的調(diào)查才能確定。由于寧夏獨特的地理環(huán)境，使倉鼠種群得到了很好的進化和發(fā)展，已發(fā)現(xiàn)16種之多[1]。監(jiān)測中倉鼠間種群的鑒定，存在不少的疑慮，特別是幼鼠。黑線倉鼠是我國華北地區(qū)比較常見的倉鼠種類。不少個體由于背上黑線不是很明顯，當捕獲標本沾水受潮時，黑線更不易察覺，因此，容易被誤定為灰倉鼠。這次在寧武臨河監(jiān)測點捕獲的黑線倉鼠標本在沾水的情況下就很難確定到底是黑線倉鼠還是灰倉鼠。通過DNA條形碼的使用，更正了形態(tài)學(xué)鑒定可能的錯誤。

我國的相關(guān)文獻至今只記錄黑線倉鼠一種[11-12]，但有人通過染色體特征分析，認為北部有黑色縱紋的倉鼠應(yīng)該分為3種，即黑線倉鼠Cricetulusbarabensis，中國倉鼠Cricetulusgriseus，和擬黝倉鼠Cricetuluspseudogriseus。但由于這個結(jié)果沒有被后人證實，所以這3個種是否成立還存在疑問[11, 13]。雖然在形態(tài)上中國倉鼠被認為是黑線倉鼠的一個亞種，但GenBank中中國倉鼠的DNA條形碼與寧夏黑線倉鼠的遺傳距離達到6%，很可能是兩個獨立的物種。因此關(guān)于黑線倉鼠是否存在形態(tài)學(xué)隱種的問題還有待進一步研究。當然在倉鼠鑒定過程中，如果能參考頭骨的形態(tài)及測量數(shù)據(jù)，將更具科學(xué)性，但無疑增加了工作量。

分布于寧夏賀蘭山一帶的鼠兔一直以來被認為是高山鼠兔的一個亞種。但近來被認為是一個獨立的種：賀蘭山鼠兔[11]。而本次調(diào)查在賀蘭山獲得的鼠兔，其DNA條形碼則與褐斑鼠兔的DNA條形碼遺傳距離比較接近，只有不到4%的差異。因此我們暫時將該份標本定位褐斑鼠兔。至于賀蘭山地區(qū)是否存在兩個不同的鼠兔種類，還有待進一步的調(diào)查。

黑線姬鼠在寧夏是流行性出血熱的重要宿主，主要分布于寧夏南部的六盤山山區(qū)。因此寧夏南部也是寧夏流行性出血熱的主要流行地區(qū)。隨著我國山區(qū)退耕還林政策的執(zhí)行，寧夏中部和南部山區(qū)的植被情況在過去的十年中得到很大改善。因此，黑線姬鼠的分布范圍也逐漸從寧夏南部的局部地區(qū)向北部逐漸擴散。本次調(diào)查在六盤山外圍的西吉縣火石寨旅游景區(qū)及農(nóng)田中捕獲了為數(shù)不少的黑線姬鼠，而且在海原縣南華山也捕獲到許多。因此，有必要對寧夏六盤山外圍地區(qū)黑線姬鼠的分布范圍和密度進行有效的監(jiān)測，對高密度地區(qū)并做好流行性出血熱的健康宣傳工作，預(yù)防流行性出血熱在當?shù)爻霈F(xiàn)暴發(fā)流行。

參考文獻：

[1]Qin CY, Li KC. Glires of Ningxia Autonomous Region and control of them[M]. Yinchuan: Ningxia People’s Press Publish, 2003: 72-78. (in Chinese)

秦長育,李克昌.寧夏嚙齒動物與防制[M].銀川:寧夏人民出版社,2003:72-78.

[2]Zhang T, Li L, Lu ST, et al. Spatial pattern of rodent population, animal plague and risk analysis in eastern part of Ningxia desert grassland[J]. Chin J Endemiol, 2013, 32(6): 645-647. DOI: 10.3760/cma.j.issn.2095-4255.2013.06.018 (in Chinese)

張濤,李麗,盧世堂,等.寧夏東部荒漠草原鼠類種群的空間格局與動物鼠疫的風險分析[J]. 中華地方病學(xué)雜志，2013，32(6)：645-647. DOI:10.3760/cma.j.issn.2095-4255.2013.06.018

[3]Zhang T, Li L, Lu ST, et al. Overview of prevention and control in loess plateau plague natural foci in Gansu Province and Ningxia for 50 years[J]. Bull Dis Ctrl Prev, 2014, 29(2): 4-6. (in Chinese)

張濤,李麗,盧世堂,等.甘寧黃土高原鼠疫自然疫源地50年防控概述[J]. 疾病預(yù)防控制通報，2014，29(2)：4-6.

[4]Zhang WS, Peng CZ, Li X, et al. Epidemiological analysis of epidemic hemorrhagic fever in Ningxia[J]. J Ningxia Med Coll, 2004, 26(6): 424-425. (in Chinese)

張文勝，彭春珍，黎唏，等. 寧夏流行性出血熱流行病學(xué)分析[J]. 寧夏醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2004，26(6)：424-425.

[5]Zhao R, Yang YR, Zhao JQ, et al. Analysis on the cases of hydatidosis in southern mountaineers of Ningxia, China[J]. China J Parasit Dis Ctrl, 2003, 16(2): 84-86. (in Chinese)

趙瑞，楊玉榮，趙嘉慶，等.寧夏南部山區(qū)包蟲病患者的調(diào)查分析[J]. 中國寄生蟲病防治雜志，2003，16(2):84-86.

[6]Robins JH, Hingston M, Matisoo-Smith E, et al. IdentifyingRattusspecies using mitochondrial DNA[J]. Mol Ecol Notes, 2007, 7: 717-729. DOI: 10.1111/j.1471-8286.2007.01752.x

[7]Ivanova NV, Zemlak TS, Hanner RH, et al. Universal primer cocktails for fish DNA barcoding[J]. Mol Ecol Notes, 2007, 7: 544-548. DOI: 10.1111/j.1471-8286.2007.01748.x

[8]Thompson JD, Higgins DG, Gibson TJ. CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, positions-specific gap penalties and weight matrix choice[J]. Nucl Acids Res, 1994, 22: 4673-4680. DOI: 10.1093/nar/22.22.4673

[9]Tamura K, Dudley J, Nei M, et al. MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) Software Version 4.0[J].Mol Biol Evol,2007,24:1596-1599. DOI: 10.1093/molebv/msm092

[10]Kimura M. A simple method for estimating evolutionary rate of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequences[J].J Mol Evol,1980,16:111-120. DOI: 10.1007/BF01731581

[11]Zheng ZM, Jiang ZK, Chen AG. Conspectus of Glires[M]. Shanghai: Shanghai Jiao Tong University Press, 2008: 1-14. (in Chinese)

鄭智民,姜志寬,陳安國.嚙齒動物學(xué)[M].上海:上海交通大學(xué)出版社,2008:1-14.

[12]Huang WJ. Chinese rodents[M]. Shanghai: Fudan University Press, 1995: 13-18. (in Chinese)

黃文幾.中國嚙齒類[M].上海,復(fù)旦大學(xué)出版社，1995:13-18.

[13]Wilson DE, Reeder DM. Mammal species of the world: A taxonomic and geographic reference[M]. Baltimore: Johns Hopkins University Press, 2005: 2142-2145.DOI: 10.1007/s10914-006-9022-6