周正斌，張 儀，呂 山，施文琦，金長發(fā)，朱淮民

白蛉屬于雙翅目毛蛉科白蛉亞科(Phlebotominae)，是一類體小多毛的吸血昆蟲，全世界已知800多種，其中約10%蛉種已被證實可傳播利什曼病等多種疾病[1-2]。特定的蛉種只能傳播特定種類的利什曼原蟲。傳統(tǒng)形態(tài)學蛉種鑒定存在局限性，其受發(fā)育狀態(tài)的限制。白蛉主要依據(jù)成蟲的內(nèi)部解剖結構、外部形態(tài)，或者雄蟲外生殖器的形態(tài)特征進行蛉種鑒定，卵、幼蟲、蛹等非成蟲蟲態(tài)一般難以鑒定。肢體殘缺的成蛉很容易造成種類鑒定不準確或者無法鑒定。而培養(yǎng)一個傳統(tǒng)的分類工作者往往需要數(shù)年的專業(yè)培訓，不斷縮減的分類學家隊伍，使分類學發(fā)展面臨巨大的挑戰(zhàn)。DNA條形碼技術是利用分子標記的序列差異將物種鑒定到種水平的一種方法[3]，在物種鑒定方面顯示了獨特的優(yōu)勢[4]。目前DNA條形碼技術已被廣泛應用于昆蟲物種的鑒定[5-7]。然而國內(nèi)利用DNA條形碼技術進行蛉種鑒定的報道并不多，本文旨在探索基于COI基因的DNA條形碼技術是否可以用于我國常見蛉種的鑒定。另外，通過分析種內(nèi)種間的序列差異，確定白蛉種內(nèi)、種間及屬間關系，為白蛉DNA條形碼的研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 供試白蛉樣本采集地、樣本數(shù)、序列數(shù)和GenBank登錄號或者序列號見表 1。

表1 本研究中所用蛉種

1.2白蛉形態(tài)學鑒定 取白蛉的頭部和尾部，以10% KOH消化后，根據(jù)白蛉的咽甲、受精囊或者雄性尾器特征鑒定其種類[9-10]。余下部分用于提取基因組DNA。

1.3分子試驗方法 按照Krueger等[11]方法單只白蛉提取基因組DNA，擴增線粒體COI基因按照Hebert等[12]方法。對樣本進行擴增，在2%瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測?？寺『蜏y序:利用AXYGEN回收試劑盒(Axygen Scientific，Inc.，USA)對PCR產(chǎn)物進行純化，由上海生工公司進行序列雙向測定，以它們的一致序列為準。并用DNSP軟件包篩選單倍型。

1.4假基因甄別 本文所使用的43條COI基因序列(長度663 bp)閱讀框完整，沒有出現(xiàn)堿基的缺失和插入現(xiàn)象，所有序列均能翻譯成氨基酸序列，說明未被核基因中的假線粒體基因序列干擾。

1.5系統(tǒng)發(fā)生分析 獲得的DNA序列先提交至GenBank數(shù)據(jù)庫中，然后用BLAST工具進行序列分析、DNA序列檢索；用Genedoc軟件進行序列同源性比較；用BioEdit軟件進行序列編輯;用ClustalX[13]軟件進行序列比對；比對結果輸入MEGA 4[14]軟件，采用距離法計算序列間的遺傳距離，并基于Kimura 2-parameter模型，用鄰接法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，通過1 000次檢驗獲得系統(tǒng)樹分支的置信度。用DAMBE 5.1.2[15]軟件分析核苷酸取代的飽和度。

2 結 果

2.1基于COI的序列差異及飽和度分析 本試驗研究了來自白蛉亞科3個屬9物種線粒體COI部分片段。這是一段基因片段長663 bp的片段，無堿基的插入和缺失，變異位點218個，占32.9%；簡約信息位點204個，占30.8%。序列的堿基組成：A：28.8%，G：16.1%，C：17.3%，T：37.9%，AT平均含量66.7%。經(jīng)過MEGA4的計算，9個物種的兩兩核苷酸差異統(tǒng)計結果(表2)顯示各蛉種種內(nèi)線粒體COI核苷酸遺傳距離均小于2%，種內(nèi)核苷酸遺傳距離0.2%～1.6%，種間核苷酸遺傳距離5.9%～17.2%，種間遺傳距離遠遠大于種內(nèi)遺傳距離。屬間核苷酸遺傳距離12.0%～14.8%，見表3。

表2 白蛉COI序列的種間遺傳距離

表3 白蛉COI 序列的屬內(nèi)屬間遺傳距離

將線粒體COI基因序列成對比較，推斷的堿基替代數(shù)同GTR距離進行比較來驗證白蛉COI基因中是否存在突變飽和現(xiàn)象。線粒體COI基因序列位點轉換(S)和顛換(V)序列差異散點圖(圖1)顯示，顛換未發(fā)生突變飽和，但轉換表現(xiàn)出明顯的飽和現(xiàn)象。

2.2基于COI構建的系統(tǒng)發(fā)育樹 本研究一共獲得我國白蛉亞科9個物種的43條線粒體COI序列。以筠連秦蛉的COI序列為外群，通過1 000次重復抽樣檢驗獲得系統(tǒng)樹分支的置信度，9蛉種都以較高的置信度各成一個進化支，但亞屬內(nèi)物種的系統(tǒng)發(fā)生關系并沒有被很好地確定，如圖2所示。

圖1 白蛉亞科9蛉種的轉換(S)、顛換(V)數(shù)目和基于GTR模型的COI基因序列遺傳距離成對比較所得的遺傳距離散點圖

3 討 論

本文探討了COI基因用于我國常見蛉種鑒定的DNA 條形碼技術及系統(tǒng)發(fā)育問題。

加拿大動物學家Hebert[3]等對動物界，包括脊椎動物和無脊椎動物共11門13 320個物種的線粒體細胞色素C氧化酶亞基基因序列比較分析，除腔腸動物Cnidaria外，98%的物種遺傳距離差異在種內(nèi)0%～2% ，種間平均可達到11.3%。本研究表明，種內(nèi)的個體間差異遠遠小于 Hebert 等提出的2%的標準，種間遺傳距離平均為11.1%，遠遠大于種內(nèi)遺傳距離，線粒體COI的序列數(shù)據(jù)和NJ樹支持了形態(tài)學上鑒定的種的地位，如圖2(A)。由于COI序列核苷酸取代飽和，這可能影響了高階元屬的分類結果，當只取COI序列編碼蛋白密碼子的第一、二位核苷酸構建進化樹時，不同屬的物種可以清楚地區(qū)分開來，如圖2(B)。DNA條形碼與DNA分類是不同的。雖然DNA條形碼也用系統(tǒng)發(fā)育分析樹來做分析，但僅僅是為了驗證物種的單源性和聚類關系，通常要求所用分析方法簡潔、快速，所以這些樹并不能看做系統(tǒng)發(fā)育樹。而DNA分類在為物種鑒定提供平臺的同時，還需要探討物種的系統(tǒng)發(fā)育、高階元分類地位等深層次的問題，并且要用到多種軟件、多種算法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，運算較復雜。本研究顯示在亞屬水平上基于線粒體COI序列的NJ樹與形態(tài)學分類有差異，如在傳統(tǒng)形態(tài)學中冷氏白蛉、吳氏白蛉同屬白蛉屬勞蛉亞屬，親緣關系較近[16]，但是以p-distance計算冷氏白蛉與吳氏白蛉種間遺傳距離(0.151)大于冷氏白蛉與阿蛉亞屬中華白蛉間的遺傳距離(0.059)，以NJ法構建的分子進化樹也顯示了相同的結果。本研究DNA條形碼為DNA分類提供了部分數(shù)據(jù)，可以作為DNA分類系統(tǒng)的初步實踐，但對于我國白蛉DNA分類有待于進一步深入研究。

圖2 基于43條白蛉COI序列所構建的系統(tǒng)發(fā)育樹

在分子進化過程中，由mtDNA片段轉移到核序列中而形成的細胞核線粒體假基因(Numts)廣泛存在于無脊椎動物細胞中。Numts序列和目的mtDNA序列協(xié)同擴增將嚴重影響DNA條形碼研究。但通過采用多種方法可以避免和解決Numts的擴增問題，如利用是否存在電泳雜帶、測序雙峰、背景噪音等現(xiàn)象而無法獲取目的序列等現(xiàn)象可以初步判斷PCR產(chǎn)物中是否存在Numts。Numts一般含有閱讀框內(nèi)終止密碼子、插入缺失或點突變位點等，對獲得條形碼序列對序列進行分析，通過檢測成分偏向性，是否能正確翻譯以及與相近種序列比對可以確定序列是否為目的COI序列[17]。此外采用RT-PCR技術或設計特異引物對物種進行特異擴增將有效避免這一問題[18-19]。

線粒體基因屬于母系遺傳，可能會由于種間線粒體基因交流出現(xiàn)一些導致錯誤鑒定的現(xiàn)象。比如:種間雜交和內(nèi)共生菌(如:沃爾巴克wolbachia)感染，所導致的對線粒體基因的間接選擇[20]。目前國內(nèi)尚未見白蛉wolbachia感染的報道，但以色列、埃及境內(nèi)的Phlebotomuspapatasi中已發(fā)現(xiàn)沃爾巴克菌感染[21]。沃爾巴克等內(nèi)共生菌的存在，會造成寄主 mtDNA 多態(tài)性降低或提高，從而影響基于mtDNA的 DNA 條形碼及系統(tǒng)發(fā)育研究。因此在解決一些特殊類群，或處理一些特殊情況如假基因、基因交流等時，需要再加一條候補基因如核基因等[22]。選取多個基因共同用于物種鑒定不僅能豐富分子分析數(shù)據(jù)，而且能使鑒定與分析更為準確。

DNA 條形碼不能取代形態(tài)學分類，而是二者相輔相成，DNA 條形碼數(shù)據(jù)能引導形態(tài)數(shù)據(jù)分析更為仔細。顯著的 DNA 條形碼差異與形態(tài)學特征以及生態(tài)學等研究相結合才能在物種鑒定中取得最有效的結論。綜上所述，基于線粒體 COI 基因的 DNA 條形碼在白蛉蛉種的種、屬水平上可以很好的區(qū)分，可以作為一種有效的工具在白蛉物種鑒定中進行應用。

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