顧夢(mèng)杰，李友松，董惠芬，趙琴平

并殖吸蟲(Paragonimus)隸屬扁形動(dòng)物門、吸蟲綱、復(fù)殖目、并殖科、并殖亞科，大多寄生于獸類，其幼蟲在宿主體內(nèi)四處游走竄擾，成蟲在終宿主的肺部定居而引起肺吸蟲病(Paragonimiasis)。迄今為止，已報(bào)道并殖吸蟲屬的典型種有：衛(wèi)氏并殖吸蟲、斯氏并殖吸蟲、大平并殖吸蟲和異盤并殖吸蟲等30多種。能引起典型的人體肺吸蟲病的主要有8種，包括：衛(wèi)氏并殖吸蟲、宮崎并殖吸蟲、斯氏并殖吸蟲、異盤并殖吸蟲、雙側(cè)宮并殖吸蟲、非洲并殖吸蟲、克氏并殖吸蟲和墨西哥并殖吸蟲[1]。其中，衛(wèi)氏并殖吸蟲分布最為廣泛，是導(dǎo)致人體肺吸蟲病的重要病原體。隨著世界范圍內(nèi)不同蟲種的陸續(xù)報(bào)道，有必要對(duì)其進(jìn)行科學(xué)統(tǒng)一的鑒定和分類。系統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類明確了許多蟲種間的表觀差異，近年的分子生物學(xué)研究揭示了并殖吸蟲的遺傳變異具有多態(tài)性。本文主要對(duì)并殖吸蟲的分類和遺傳多樣性的相關(guān)研究作一綜述。

1 分類學(xué)研究

1.1形態(tài)學(xué) 最早發(fā)現(xiàn)的并殖吸蟲是在南美巴西水獺體內(nèi)，當(dāng)時(shí)將其命名為粗壯雙口吸蟲(DistomarudeDiesing, 1850)[2]，但因?qū)ζ湫螒B(tài)學(xué)描述簡(jiǎn)單，且再未檢獲該樣本，所以對(duì)其身份仍存疑。后在印度獴(Mongoose)的肺部發(fā)現(xiàn)了一種堅(jiān)實(shí)雙口吸蟲(D.compactumCobbold, 1859)[3]，這是最早確定為并殖吸蟲的蟲種。1877年，Westerman在對(duì)一只孟加拉虎進(jìn)行尸檢時(shí)，在其肺部發(fā)現(xiàn)寄生蟲，荷蘭動(dòng)物學(xué)家Kerbert通過(guò)形態(tài)學(xué)，對(duì)該蟲體和與其它吸蟲對(duì)比后，鑒定其為新種，并定名為：衛(wèi)氏雙口吸蟲(D.westermaniKerbert, 1878)[4]。次年，發(fā)現(xiàn)該類吸蟲能引起人類疾病，第一例人體感染的病例報(bào)告發(fā)生在尚為葡屬殖民地的中國(guó)臺(tái)灣，英國(guó)醫(yī)生Ringer在對(duì)病人尸檢時(shí)發(fā)現(xiàn)蟲體，經(jīng)英國(guó)學(xué)者Cobbold確認(rèn)，將這種在人體內(nèi)獲得的吸蟲命名為林氏雙口吸蟲(D.ringeriCobbold, 1880)[5]。兩月后，Baelz在日本也發(fā)現(xiàn)在人體中寄生的肺吸蟲，將其命名為肺生雙口吸蟲(D.pulmonalisBaelz, 1880)[6]。隨后，有學(xué)者認(rèn)為寄生在虎肺內(nèi)的衛(wèi)氏雙口吸蟲與寄生在人肺內(nèi)的肺生雙口吸蟲在形態(tài)學(xué)特征上表現(xiàn)一致，遂統(tǒng)稱為衛(wèi)氏雙口吸蟲[7]。Braun于1899年將雙口吸蟲屬(GenusDistoma)改為并殖吸蟲屬(GenusParagonimus)，并將衛(wèi)氏并殖吸蟲作為并殖屬的模式種，以觀察成蟲形態(tài)差異，作為區(qū)分并殖吸蟲和其他種類吸蟲的主要手段[6]。

1.1.1成蟲 1915年Ward 和Hirsch[8]比較了林氏(ParagonimusringeriCobbold, 1880)、衛(wèi)氏(P.westermaniKerbert, 1878)和首次在北美發(fā)現(xiàn)的克氏(P.kellicottiWard, 1908)三類并殖吸蟲的成蟲形態(tài)，發(fā)現(xiàn)：林氏的體棘為濃密鑿狀叢生型，衛(wèi)氏的體棘為稀疏細(xì)針狀單生型，而克氏則為濃密鑿狀單生型。因此，認(rèn)為成蟲體棘的形態(tài)和排列特征可作為劃分并殖吸蟲屬下各種(當(dāng)時(shí)僅報(bào)告有5種)的分類依據(jù)。Vevers[9]于1923年重新觀察了上述3種并殖吸蟲和堅(jiān)實(shí)并殖吸蟲(P.compactusCobblold, 1859)的形態(tài)，肯定了成蟲體棘在區(qū)分并殖屬各成員中的分類學(xué)意義。Ameel[10]在研究克氏并殖吸蟲生活史時(shí)，發(fā)現(xiàn)克氏并殖吸蟲的體棘大小、形狀和分布情況在蟲體的不同部位或不同個(gè)體間存在較大的變異，且隨著蟲齡的增長(zhǎng)，體棘會(huì)由細(xì)針狀變粗，針尖變鈍，呈鑿狀。因此，認(rèn)為體棘特征不宜作為并殖吸蟲的分類依據(jù)。我國(guó)學(xué)者在對(duì)四川肺吸蟲(P.szechuanensicChung & T’sao, 1962)(現(xiàn)證明是斯氏并殖吸蟲(P.skrjabiniChen, 1959)的同物異名)生活史的研究中亦發(fā)現(xiàn)，成蟲體棘的形狀和排布存在過(guò)渡型[11]。

1974年Miyasaki[12]報(bào)道了卵巢的形狀和睪丸的大小在并殖吸蟲不同種間的差異，例如衛(wèi)氏并殖吸蟲卵巢為6頁(yè)扇狀葉片，墨西哥并殖吸蟲(P.mexicanusMiyazaki&Ishii, 1968)則為纖細(xì)的分支；巨睪并殖吸蟲(P.macrorchisChen, 1962)的睪丸巨大，而哈氏并殖吸蟲(P.harinasutaiMiyazaki&Vajrasthira, 1968)和亞馬遜并殖吸蟲(P.amazonicusMiyazaki, Grados&Uyema, 1973)的睪丸則較小，認(rèn)為生殖器官的形態(tài)學(xué)差異可用于并殖吸蟲種間的鑒別。

此外，成蟲的長(zhǎng)寬比和吸盤相對(duì)位置在蟲種間亦有區(qū)別。衛(wèi)氏并殖吸蟲、大平并殖吸蟲(P.ohiraiMiyazaki, 1939)和異盤并殖吸蟲(P.heterotremusChen&Hsia, 1964)等成蟲的蟲體寬長(zhǎng)比通常在1∶2以下，腹吸盤位于體中線處，而斯氏并殖吸蟲的成蟲寬長(zhǎng)比則達(dá)1∶2.4以上，腹吸盤偏移到體前側(cè)1/3處[13-17]。

1.1.2囊蚴 不同蟲種間囊蚴的變異特征最多。囊蚴的大小和形狀、囊壁的有無(wú)和厚薄、吸器的相對(duì)直徑、排泄囊的位置、口咽針的有無(wú)和長(zhǎng)度、彩色顆粒的有無(wú)[18]、焰細(xì)胞的數(shù)量、體棘和吸器周圍的乳突(Papillae)排列等，均在種間有不同程度的差異。豐宮并殖吸蟲(P.proliferusHsia&Chen, 1964)的囊蚴直徑可達(dá)0.75 mm以上，常呈橢圓形，大平并殖吸蟲的囊蚴直徑僅約0.25 mm。衛(wèi)氏和斯氏等大多數(shù)并殖吸蟲具有2層囊壁，怡樂(lè)村并殖(P.iloktsuenensisChen, 1940)(大平并殖吸蟲的同物異名)和卡里并殖吸蟲(P.caliensisLittle, 1968)則僅有1層囊壁，極少數(shù)種類例如墨西哥并殖吸蟲則沒(méi)有囊壁，不過(guò)亦有人認(rèn)為可能是由于囊壁太薄而在取樣時(shí)丟失[7]。陳心陶曾根據(jù)焰細(xì)胞數(shù)量將并殖科分為并殖屬和貍殖屬，因?yàn)榇蠖鄶?shù)并殖屬吸蟲的焰細(xì)胞數(shù)目為60個(gè)，而斯氏并殖、豐宮并殖和曼谷并殖吸蟲的焰細(xì)胞數(shù)則為72個(gè)[19]，但因該分類依據(jù)單一，并未得到國(guó)際學(xué)界的廣泛認(rèn)可。

種內(nèi)的囊蚴也存在一定程度的特征變異。在電鏡下觀察同種大平并殖吸蟲的囊蚴，其內(nèi)囊壁在個(gè)體間或有或無(wú)[20]。曾經(jīng)認(rèn)為宮崎并殖吸蟲的囊蚴大于衛(wèi)氏并殖吸蟲的囊蚴，但隨后發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)的衛(wèi)氏并殖吸蟲囊蚴大小相差很大，最小的與大平并殖吸蟲囊蚴大小近似(直徑約250μm)，最大的可超過(guò)豐宮并殖吸蟲囊蚴(直徑約750μm)。

1.1.3蟲卵 不同種的蟲卵亦存在大小、形狀和卵殼特征的差異。衛(wèi)氏并殖吸蟲的二倍體蟲卵明顯小于三倍體蟲卵，且最寬處接近蟲卵橫中線，而三倍體蟲卵的最寬處則接近卵蓋[21]。多數(shù)并殖吸蟲卵殼光滑，如克氏并殖吸蟲和大平并殖吸蟲，也有部分蟲種的卵殼呈凹凸?fàn)罨蛉轭^狀突起，如衛(wèi)氏并殖吸蟲和墨西哥并殖吸蟲[22]。

隨著越來(lái)越多的新種被報(bào)道，一貫沿用的形態(tài)學(xué)上的分類依據(jù)逐漸受到挑戰(zhàn)；特別在進(jìn)行大樣本量的觀察時(shí)，發(fā)現(xiàn)其并不適用于種內(nèi)變異度高的蟲種。某些新性狀的出現(xiàn)可能僅由偶然因素導(dǎo)致，比如：衛(wèi)氏并殖吸蟲的囊蚴在形成過(guò)程中，由于寄生部位壓力不均，發(fā)育為扁形，而得名為扁囊并殖吸蟲[23]；將泡囊并殖吸蟲的囊蚴置于生理鹽水中，排泄囊可由寬變細(xì)，經(jīng)生活史循環(huán)試驗(yàn)和DNA檢測(cè)，確認(rèn)為斯氏并殖吸蟲的畸形囊蚴[24]。

迄今，尚無(wú)一種特異性的形態(tài)學(xué)特征可作為并殖吸蟲種間的分類依據(jù)，蟲種的鑒別一般需根據(jù)囊蚴、成蟲和蟲卵等的形態(tài)綜合判斷。我國(guó)已有學(xué)者總結(jié)以往經(jīng)驗(yàn)，以成蟲或囊蚴的形態(tài)特點(diǎn)為基本依據(jù)，建立了中國(guó)的并殖吸蟲分種檢索表[25]，為我國(guó)并殖吸蟲的調(diào)查研究和分類識(shí)別提供了參考資料。

1.2分子分類 隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，基因序列標(biāo)記的運(yùn)用使得研究物種間的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系成為可能。根據(jù)核基因序列可以判斷個(gè)體的雜合或純合情況，由堿基序列的同源性程度能夠量化群體間的親緣關(guān)系；根據(jù)線粒體基因組序列，可以推知家系起源。得益于此，在對(duì)并殖吸蟲種系關(guān)系的探索中，分子證據(jù)極大地豐富了我們對(duì)并殖屬吸蟲大家族的認(rèn)識(shí)。

1.2.1核基因標(biāo)記 內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(Internal transcribed spacer, ITS)位于染色體上rRNA的大小亞基之間，包括ITS1和ITS2，因其具有拷貝多、易擴(kuò)增、種間變異度高等特點(diǎn)，常被用于系統(tǒng)發(fā)育研究。Herwerden[26]研究發(fā)現(xiàn)，衛(wèi)氏并殖吸蟲的ITS1重復(fù)區(qū)在個(gè)體內(nèi)具有1～3個(gè)重復(fù)單元組成的串聯(lián)變體，而大平并殖吸蟲僅有唯一的一種串聯(lián)單元。此外，衛(wèi)氏并殖吸蟲等位基因間的協(xié)同進(jìn)化速率較慢，提示其染色體聯(lián)會(huì)時(shí)交叉頻率F.X.(The frequency of chiasma formation)可能低于大平并殖吸蟲。在對(duì)ITS1的3′端的后重復(fù)區(qū)的分析中發(fā)現(xiàn)，衛(wèi)氏并殖吸蟲的個(gè)體間變異程度遠(yuǎn)大于大平并殖吸蟲，其種群擁有更多的遺傳多樣性。ITS2則更為保守[27]，中國(guó)的斯氏并殖吸蟲與日本的宮崎并殖吸蟲的ITS2序列完全相同；中國(guó)臺(tái)灣、日本、菲律賓和馬來(lái)西亞等地衛(wèi)氏并殖吸蟲樣本的ITS2序列僅有數(shù)個(gè)堿基的差異；此外，并殖吸蟲屬種間堿基置換率亦低于10%[28]。因此，ITS2可作為分析并殖吸蟲屬種間關(guān)系的良好標(biāo)記，但無(wú)法用于種內(nèi)遺傳結(jié)構(gòu)的研究。

Jarilla[29]在對(duì)吸蟲和軟體動(dòng)物激酶的進(jìn)化關(guān)系研究中發(fā)現(xiàn)，衛(wèi)氏并殖吸蟲的脒基?；撬峒っ?Taurocyamine kinase, TK)基因是一個(gè)雙域編碼序列，由軟體動(dòng)物的精氨酸激酶(Arginine kinase, AK)基因進(jìn)化而來(lái)。脒基?；撬峒っ竻⑴c?；撬岷蛠喤；撬岽x，催化磷酸基團(tuán)在ATP和脒基?；撬嶂g的可逆轉(zhuǎn)移。Saijuntha等[30]以TK基因1號(hào)域第2內(nèi)含子(The second intron of domain 1 of the taurocyamine kinase gene, TKD1int2)序列作為分子標(biāo)記，對(duì)衛(wèi)氏、大平、怡樂(lè)村和宮崎并殖吸蟲進(jìn)行遺傳變異分析，結(jié)果顯示：大平并殖吸蟲TKD1int2序列有11處位點(diǎn)變異，怡樂(lè)村并殖吸蟲則無(wú)變異；宮崎并殖吸蟲有4個(gè)位點(diǎn)存在變異；衛(wèi)氏并殖吸蟲則多達(dá)108個(gè)變異位點(diǎn)；聚類分析不能區(qū)分大平并殖吸蟲和怡樂(lè)村并殖吸蟲。該研究再次證實(shí)了衛(wèi)氏并殖吸蟲在種內(nèi)呈高度變異，較其他蟲種種群遺傳多樣性更高，同時(shí)提示了大平并殖吸蟲和怡樂(lè)村并殖吸蟲可能為同一蟲種，與ITS2和CO1的檢測(cè)結(jié)果相符[31]，但是兩蟲種間的變異度不同，亦提示兩者間可能存在分化。

1.2.2線粒體基因標(biāo)記 細(xì)胞色素c氧化酶(Cytochrome c oxidase, COX)是有氧代謝的關(guān)鍵酶，作用于線粒體氧化磷酸化反應(yīng)的最后階段，參與電子鏈傳遞。細(xì)胞色素c氧化酶亞基I(CO1)是細(xì)胞色素c氧化酶的主要亞基。CO1序列在并殖吸蟲種內(nèi)具有更多的變異位點(diǎn)，能夠?yàn)樾l(wèi)氏并殖吸蟲的種內(nèi)遺傳結(jié)構(gòu)研究提供更豐富的信息，可區(qū)分ITS2不能區(qū)分的斯氏并殖吸蟲和宮崎并殖吸蟲(P.miyazakiiKamo et al., 1961)，但由于并殖吸蟲屬CO1序列堿基置換數(shù)已近飽和，在計(jì)算差異較大的兩類并殖吸蟲的遺傳距離時(shí)，常會(huì)低估兩者的分化程度[28]。因此，將CO1與ITS2兩種標(biāo)記一起使用，更有利于蟲種鑒別和發(fā)育關(guān)系分析。2007年Doanh等在越南北部檢獲一種大型囊蚴，與巨睪并殖吸蟲和豐宮并殖吸蟲等的囊蚴形態(tài)有部分相似，但對(duì)其CO1和ITS2序列的聚類分析顯示，該種獨(dú)立成一支，與其他已知種隔離，故認(rèn)為其為新種，命名為越南并殖吸蟲(P.vietnamensis)[32]。此外，作者對(duì)另一種形似豐宮并殖吸蟲的大囊蚴，進(jìn)行CO1和ITS2序列分析，鑒定其為河口并殖吸蟲，此為首次報(bào)道越南境內(nèi)河口并殖吸蟲的分布[33]。除CO1外，亦有學(xué)者嘗試?yán)镁€粒體NADH脫氫酶亞基1(NADH dehydrogenase subunit 1, ND1)基因進(jìn)行并殖吸蟲的分類學(xué)研究[34]，但由于ND1在并殖吸蟲個(gè)體內(nèi)為多拷貝，使其無(wú)法廣泛運(yùn)用于系統(tǒng)發(fā)育分析[35]。

2 種群遺傳多樣性

2.1種內(nèi)多樣性 以模式種衛(wèi)氏并殖吸蟲為例，種內(nèi)的成蟲、蟲卵和囊蚴大小存在較大差異。成蟲體長(zhǎng)5.1 mm～15 mm，寬3.7 mm～6.3 mm，寬長(zhǎng)比1∶(1.3～2.3)；蟲卵大小也隨宿主、地區(qū)和蟲齡不同存在差異，長(zhǎng)寬范圍為(51～102)μm×(38～72)μm[7]。東亞地區(qū)的衛(wèi)氏并殖吸蟲囊蚴呈圓形，內(nèi)囊壁較厚，三倍體囊蚴長(zhǎng)寬范圍為(348～412)μm×(328～396)μm，大于二倍體的(276～368)μm×(272～360)μm[21, 36]。而印度東北地區(qū)和斯里蘭卡的囊蚴則含卵形，內(nèi)囊壁較薄，大小分別約為656 μm×465 μm和709 μm×492 μm[37-38]，經(jīng)成蟲的形態(tài)學(xué)和分子鑒定均為衛(wèi)氏并殖吸蟲，作者推測(cè)這種形狀變化可能與囊蚴在中間宿主體內(nèi)的寄生位置有關(guān)。此外，在分子水平上，Blair[28]使用ITS2與CO1序列，對(duì)中國(guó)(福建省和臺(tái)灣省)、日本、韓國(guó)、菲律賓、馬來(lái)西亞和泰國(guó)等地的衛(wèi)氏并殖成蟲構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，按遺傳距離的遠(yuǎn)近將其分為兩個(gè)地域組群，中國(guó)、日本和韓國(guó)等地株系為東北組群，菲律賓、馬來(lái)西亞和泰國(guó)等地理株為南部組群。兩群間遺傳差異較大，對(duì)中間宿主螺的種屬選擇上也有差異。并且不同地理株間CO1基因變異度很高，東北組群和南部組群地理株之間的CO1基因遺傳距離甚至與不同種的斯氏并殖吸蟲和宮崎并殖吸蟲的種間遺傳距離相似。Iwagami[39]同樣使用ITS2和CO1基因?qū)喼扌l(wèi)氏并殖吸蟲進(jìn)行了發(fā)育關(guān)系研究，結(jié)果與Blair相似，中國(guó)(吉林省、遼寧省、湖北省、浙江省、福建省和臺(tái)灣省)、日本和韓國(guó)，除中國(guó)臺(tái)灣省有一處位點(diǎn)變異外，其他樣本的ITS2序列完全一致，與菲律賓、馬來(lái)西亞和泰國(guó)樣本差異明顯。根據(jù)CO1基因的聚類結(jié)果，中、日、韓的所有樣本之間遺傳距離較近，獨(dú)立于菲律賓、馬來(lái)西亞和泰國(guó)類群分支外。

不同地區(qū)的衛(wèi)氏并殖吸蟲所寄生的適宜宿主亦有所差異。中國(guó)、日本和韓國(guó)等東亞地區(qū)的地理株多以短溝蜷(GenusSemisulcospiru)為第一中間宿主；而馬來(lái)西亞和菲律賓株則多以川蜷螺(GenusBrotia)[6]為第一中間宿主。日本和臺(tái)灣地區(qū)的衛(wèi)氏并殖吸蟲二倍體多以澤蟹(GenusGeothelphusa)為第二中間宿主，而該地區(qū)的三倍體則多以日本絨螯蟹(Eriocheirjaponicus)為第二中間宿主；中國(guó)東北的衛(wèi)氏并殖吸蟲二、三倍體均以喇蛄(GenusCambaroides)[40]為第二中間宿主，福建的衛(wèi)氏并殖吸蟲二、三倍體多以華溪蟹(GenusSinopotamon)[41]為第二中間宿主。貓、狗是衛(wèi)氏并殖吸蟲常見(jiàn)的終宿主，但馬來(lái)西亞的衛(wèi)氏并殖吸蟲囊蚴感染貓和狗后，只有少數(shù)能發(fā)育為成蟲，多數(shù)囊蚴則只能在宿主肌肉中發(fā)育到童蟲期，若將其肌肉中的童蟲重新投喂給其它貓或狗，方能繼續(xù)發(fā)育，并可在終宿主肺部檢獲大量成蟲[42]。嚙齒動(dòng)物通常僅作為衛(wèi)氏并殖吸蟲的轉(zhuǎn)續(xù)宿主，但也有報(bào)道日本兵庫(kù)縣、千葉縣和三重縣的衛(wèi)氏并殖吸蟲能夠在大鼠體內(nèi)發(fā)育成熟[43]。

2.2種間交流 Doanh等[44]在越南廣平省發(fā)現(xiàn)有大、小囊蚴共存的溪蟹，根據(jù)囊蚴形態(tài)，大囊蚴((700～790)μm×(680～780)μm)和小囊蚴((400～450)μm×(400～450)μm)分別被判定為哈氏并殖吸蟲和曼谷并殖吸蟲。由于該地首次發(fā)現(xiàn)哈氏并殖吸蟲，特挑選哈氏并殖型大囊蚴感染貓，以收取成蟲。作者除了獲得典型的哈氏并殖型單生體棘的成蟲外，還獲得了叢生體棘的成蟲。后者具有與曼谷并殖吸蟲一致的CO1序列，但I(xiàn)TS2序列和28S rDNA R2區(qū)序列分析顯示，該成蟲為哈氏并殖吸蟲和曼谷并殖吸蟲的雜合體。提示哈氏與曼谷并殖吸蟲之間存在自然雜交，曼谷并殖吸蟲子代能夠發(fā)育為哈氏并殖型大囊蚴。在其他吸蟲中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有種間雜交現(xiàn)象，如肝片吸蟲屬的大片吸蟲(Fasciolagigantica)和肝片吸蟲(Fasciolahepatica)、裂體吸蟲屬的牛血吸蟲(Schistosomabovis)和埃及血吸蟲(Schistosomahaematobium)，曼氏血吸蟲(Schistosomamansoni)和羅海因氏血吸蟲(Schistosomarodhaini)等[45]。該研究為并殖吸蟲屬蟲種間亦可能存在的種間雜交提供了證據(jù)。

3 衛(wèi)氏并殖吸蟲三倍體的研究

3.1三倍體的定種爭(zhēng)論 衛(wèi)氏并殖吸蟲自然種群的染色體具有加倍現(xiàn)象，包括三倍體和四倍體。Sakaguchi[46]首次報(bào)道了衛(wèi)氏并殖吸蟲三倍體的存在，Miyazaki以受精囊有無(wú)精子和染色體組型為依據(jù)，將衛(wèi)氏并殖吸蟲二倍體作為基本型，特點(diǎn)是兩性生殖，而三倍體為肺生并殖吸蟲(P.pulmonalisBaelz, 1880)，特點(diǎn)是孤雌生殖、囊蚴、成蟲和蟲卵都比二倍體的大[21]。Agatsuma[47]比較了衛(wèi)氏并殖吸蟲在二倍體和三倍體間的15種酶的同工酶譜差異，發(fā)現(xiàn)其中5種酶譜在二倍型中表現(xiàn)為純合子，在三倍型中表現(xiàn)為雜合子。結(jié)合Hirai[48]的染色體C帶染色結(jié)果，即三倍體有兩條染色體的帶型與二倍體一致。因此，作者認(rèn)為：衛(wèi)氏并殖吸蟲的三倍體應(yīng)為獨(dú)立蟲種，并推測(cè)三倍體可能是二倍體偶然與其他近緣種雜交的后代。Saijuntha等[30]以TKD1int2為分子標(biāo)記，對(duì)衛(wèi)氏并殖吸蟲的二倍體和三倍體進(jìn)行了研究，亦認(rèn)為三倍體為雜合子。此外，二倍體和三倍體在其他方面亦存在差異，如寄生于人體時(shí)，二倍體所導(dǎo)致的臨床癥狀多為皮下游走性結(jié)節(jié)型，三倍體則主要為咳嗽、咳痰等肺型癥狀[49]；二倍體廣泛分布于東南亞地區(qū)，而三倍體僅分布于中國(guó)、日本和朝鮮的少數(shù)地方[50]等。

Blair[28]使用ITS2與CO1序列對(duì)中國(guó)、日本、韓國(guó)、菲律賓、馬來(lái)西亞和泰國(guó)等地的衛(wèi)氏并殖吸蟲樣本進(jìn)行聚類分析后，結(jié)果顯示：衛(wèi)氏并殖吸蟲的二倍體和三倍體型相互混雜，無(wú)法形成明顯獨(dú)立的聚類，因此認(rèn)為不宜將衛(wèi)氏并殖吸蟲三倍體作為獨(dú)立的種。但由于無(wú)法解釋兩型蟲種在形態(tài)、生殖方式和流行區(qū)分布上的種種差異，對(duì)于依據(jù)DNA序列的差異，把二倍體和三倍體歸為同一物種的觀點(diǎn)亦存在爭(zhēng)議。今后的研究需要尋找和利用更具代表性的分子標(biāo)記，以獲得更豐富的遺傳信息。

3.2三倍體地理起源的討論 由于中國(guó)、日本和韓國(guó)都有三倍體的分布，這三地三倍體的來(lái)源和系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系亦未知。Hirai和Agatsuma[51]比較了中國(guó)與日本多地區(qū)衛(wèi)氏并殖吸蟲的同工酶譜，認(rèn)為日本的衛(wèi)氏并殖吸蟲三倍體起源于中國(guó)東北。Herwerden等[52]通過(guò)限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(Restriction fragment length polymorphisms, RFLP)和微衛(wèi)星指紋技術(shù)對(duì)中國(guó)、日本和韓國(guó)等不同地域來(lái)源的衛(wèi)氏并殖吸蟲三倍體進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)不同地域間衛(wèi)氏并殖吸蟲三倍體存在差異，因此認(rèn)為不同地域的三倍體相互獨(dú)立。Agatsuma等[53]對(duì)中國(guó)、中國(guó)臺(tái)灣、日本、菲律賓等地的衛(wèi)氏并殖吸蟲二倍體、三倍體中線粒體的16S rDNA和一段非編碼區(qū)序列進(jìn)行分析。結(jié)果表明，16S rDNA序列有個(gè)體間變異，但并不能區(qū)分二倍體和三倍體；但所有地區(qū)三倍體樣本的16S rDNA和非編碼區(qū)序列均無(wú)變異，提示中、日、韓三地的衛(wèi)氏并殖吸蟲三倍體可能起源相同。

4 小 結(jié)

綜上，并殖吸蟲分布廣泛，種類眾多，作為模式種的衛(wèi)氏并殖吸蟲是亞洲最常見(jiàn)的蟲種，其種群遺傳多樣性也遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于已知的其他種，各地理種群呈現(xiàn)出不同程度的形態(tài)學(xué)、宿主適應(yīng)性差異，尤其東亞地區(qū)與南亞地區(qū)的地理株差別較大。不同于衛(wèi)氏并殖吸蟲二倍體，新的分子標(biāo)記顯示三倍體為雜合子，支持了兩型之間的異質(zhì)性，并且暗示各地的三倍體種群可能都曾起源于一個(gè)地點(diǎn)。此外，新發(fā)現(xiàn)的哈氏并殖吸蟲和曼谷并殖吸蟲種間存在自然雜交的現(xiàn)象，豐富了人們對(duì)并殖吸蟲種間關(guān)系的認(rèn)知，但是同時(shí)也模糊了蟲種之間的界限，使得分類更加困難。

以往對(duì)并殖吸蟲的鑒定通常是先觀察囊蚴或成蟲的形態(tài)學(xué)特征作初步判別，而后再聯(lián)合核基因組內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2(ITS2)和線粒體細(xì)胞色素c氧化酶(CO1)等DNA分子標(biāo)記進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析加以驗(yàn)證，一般均可取得一致的結(jié)果。對(duì)于形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)結(jié)果相矛盾的情況，則需要尋找更具代表性的分子標(biāo)記，以獲得更豐富的遺傳信息作為依據(jù)。尤其是衛(wèi)氏并殖吸蟲三倍體的澄清，應(yīng)結(jié)合生活史、形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)多個(gè)角度判斷。由于并殖吸蟲種間種內(nèi)形態(tài)特征變異較大，現(xiàn)有的分子標(biāo)記無(wú)法清晰闡釋某些蟲種之間的差異。通過(guò)全基因組水平的分析，尋找更具代表性的遺傳信息，運(yùn)用于并殖吸蟲的分類學(xué)和遺傳進(jìn)化的研究，以期望能夠獲得并殖吸蟲更明晰的分類和遺傳結(jié)構(gòu)。

利益沖突：無(wú)