陳莉

·綜述與講座·

DNA甲基化在腫瘤發(fā)生中的作用

陳莉

DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶；組蛋白去乙?；福患谆Y(jié)合蛋白;腫瘤

在腫瘤形成過程中，表觀遺傳學(xué)機制越來越受到重視。即DNA突變時核苷酸序列不變，通過堿基修飾的改變導(dǎo)致基因表達水平的變化。其中，一個重要機制就是DNA甲基化。DNA甲基化就是在DNA復(fù)制后，DNA在甲基轉(zhuǎn)移酶催化下將S-腺苷甲硫氨酸(SAM)上的甲基連接到DNA分子的腺嘌呤堿基或胞嘧啶堿基上，進行DNA修復(fù)的過程。負責(zé)DNA甲基化作用的酶稱為DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNA Methyltransferases，DNMTs)。DNA甲基化主要發(fā)生在CpG二核苷酸中的胞嘧啶[1]，它對于維持染色體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，保障基因組表觀遺傳信息在親代細胞間的正確傳遞起著重要作用。除此之外，DNMTs還直接參與基因的轉(zhuǎn)錄抑制和DNA復(fù)制的正確起始等。人類DNA甲基化系統(tǒng)的功能異常將會導(dǎo)致胚胎發(fā)育異常，亦可誘發(fā)惡性疾病甚至腫瘤的發(fā)生。近年來，國內(nèi)外開展了許多有關(guān)DNA甲基化的分子生物學(xué)及其作用機制的研究，本文就相關(guān)研究現(xiàn)狀予以綜述。

1 DNMTs家族介紹

目前在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)了3類DNMTs、Dnmt1、Dnmt2和Dnmt3，其中Dnmt3包括Dnmt3a、Dnmt3b和Dnmt3L，Dnmt3L缺乏有效的催化結(jié)構(gòu)而無催化活性，但能夠增強Dnmt3a、Dnmt3b的甲基化活性[2]。Dnmt2的結(jié)構(gòu)和功能尚不十分明確[3]，目前研究認為它的DNA甲基化酶活性可能非常弱,而且識別位點并非CpG位點,在體外酶活性實驗中,常常難以觀測到DNA甲基化酶活性。Dnmt1和Dnmt3a、Dnmt3b在DNA甲基化修飾過程中起主要作用。人類DNA甲基化的完成主要通過Dnmt1和Dnmt3a、3b的作用。Dnmt1定位與染色體19p13.2，主要功能是在每次DNA復(fù)制后，對新合成的DNA鏈進行甲基化修飾，并維持甲基化狀態(tài)的穩(wěn)定，也是非CpG位點從頭甲基化所必需的甲基化轉(zhuǎn)移酶[4]。DNMT3a定位于人染色體2p33，DNMT3b定位于人染色體20q11.2，兩者的功能主要是催化DNA甲基化新生位點，并在胚胎中建立起新的甲基化模式，即催化非甲基化的DNA成為甲基化的DNA，主要參與DNA的從頭甲基化[5]。

2 HDACs家族介紹

目前在哺乳動物中已發(fā)現(xiàn)18個組蛋白去乙酰化酶( histone deacetylase，HDAC)，依據(jù)與酵母蛋白的同源性這些酶被分為三類。第Ⅰ類通常存在于細胞核內(nèi)，包括HDAC1、HDAC2、HDAC3和HDAC8；第Ⅱ類通常能在細胞核與細胞質(zhì)間穿梭，包括HDAC4、5、6、7、9和10；第Ⅲ類與前兩類的結(jié)構(gòu)完全不同，與酵母Sir2家族蛋白具有同源性，參與調(diào)節(jié)細胞的衰老和能量代謝，且不能被HDACs抑制劑曲古菌素A(trichostatin A,TSA)抑制。

3 DNMTs與HDACs的相互聯(lián)系

有研究發(fā)現(xiàn)了5種甲基化結(jié)合蛋白(methyl-CpG binding proteins),MBD1、MBD2、MBD3、MBD4和MeCP2。MBD1、MBD2、MBD4能夠與mCpG結(jié)合，MBD3沒有特異性結(jié)合甲基化DNA的能力[6]。其中，MeCP2是唯一能識別單個甲基化CpG位點的結(jié)合蛋白，MeCP2能夠通過轉(zhuǎn)錄抑制區(qū)(TRD)與半甲基化,全甲基化DNA形成復(fù)合物。Kitamoto等[7]研究認為，啟動子區(qū)DNA甲基化與組蛋白的乙?；揎椌哂袇f(xié)同抑制基因轉(zhuǎn)錄的作用。Nan等[8]研究證明甲基化CpG結(jié)合蛋白與組蛋白去乙?；腹泊嬗谝粋€細胞復(fù)合物中，因而認為DNA甲基化與組蛋白去乙?；谡{(diào)控基因轉(zhuǎn)錄中密切相關(guān)。Fuks等[9]通過實驗證明了DNMT1能直接與HDAC結(jié)合，并確定了特異性結(jié)合位點，這一發(fā)現(xiàn)更直接地證明DNA甲基化與組蛋白去乙?；g的協(xié)調(diào)作用。但是組蛋白去乙?；种苹蜣D(zhuǎn)錄的作用依賴于甲基化CpG位點的數(shù)目。高密度的DNA甲基化使染色質(zhì)結(jié)構(gòu)高度緊縮并且非常穩(wěn)定，從而抑制基因轉(zhuǎn)錄。

4 DNA甲基化的機制

DNA甲基化是一種表觀遺傳修飾，它不改變DNA的一級結(jié)構(gòu)而調(diào)控組織特異性基因的表達。哺乳動物的DNA甲基化主要發(fā)生在CpG二核苷酸的胞嘧啶上，由DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferases，DNMTs)催化完成，將S-腺苷甲硫氨酸(SAM)提供的的甲基基團轉(zhuǎn)移至胞嘧啶的第5位碳原子上,使胞嘧啶甲基化為5-甲基胞嘧啶，最終完成DNA甲基化修飾過程。而DNA甲基轉(zhuǎn)移酶是參與DNA甲基化過程的關(guān)鍵酶?；蚪MDNA中CpG二核苷酸結(jié)構(gòu)高度聚集在一起，稱為CpG島。CpG島為二聯(lián)核苷(GC)含量>50%，長度>200 bp的DNA序列，主要位于管家基因和一些組織特異性基因的5’端，覆蓋基因轉(zhuǎn)錄的啟動子區(qū)和第一外顯子，有時延伸到第一內(nèi)含子，約60%的人類基因組啟動子區(qū)含有CpG島[10]。通過DNA甲基敏感限制性內(nèi)切酶分析,發(fā)現(xiàn)人類基因組的甲基化與非甲基化區(qū)域間隔排列，非甲基化區(qū)主要存在于啟動子區(qū)CpG島、基因的5’端和第一個外顯子區(qū)[11]。目前的研究發(fā)現(xiàn)，DNA甲基化的主要靶點是在基因編碼區(qū)，但基因轉(zhuǎn)錄區(qū)甲基化并不關(guān)閉基因的表達，而啟動子區(qū)CpG島甲基化引起穩(wěn)定的基因沉默,而轉(zhuǎn)錄區(qū)域的甲基化有助于消除轉(zhuǎn)錄噪音[12]。

CpG二核苷酸中的胞嘧啶甲基化是人類基因組中最主要的表觀遺傳改變。抑癌基因啟動子區(qū)域CpG島的甲基化通過一個涉及組蛋白去乙?；腿旧|(zhì)緊縮的復(fù)雜過程而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄抑制。Dnmts與組蛋白修飾相關(guān)因子的相互作用是Dnmt調(diào)控基因表達的重要手段。Dnmt1的N末端可以與HDAC1、HDAC2結(jié)合,Dnmt3a和Dnmt3b也可以招募HDAC,從而使組蛋白去乙酰化[13]。Worthley等[14]研究表明，DNA甲基化能引起染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA、DNA穩(wěn)定及DNA與蛋白質(zhì)作用方式的改變，抑制基因轉(zhuǎn)錄從影響基因表達。

一般認為啟動子區(qū)DNA甲基化通過兩種途徑抑制基因表達：第一種是甲基化CpG島的甲基基團可以阻止特異性轉(zhuǎn)錄因子與啟動子CpG位點的結(jié)合,直接抑制基因轉(zhuǎn)錄[15];另一種是通過DNA甲基結(jié)合蛋白(methyl-CpG-binding proteins,MBD)招募一些阻礙復(fù)合物,可以和啟動子區(qū)甲基化DNA特異性結(jié)合，競爭性抑制了轉(zhuǎn)錄因子與特定的DNA序列的結(jié)合,間接抑制基因轉(zhuǎn)錄[16]。組織特異性基因啟動子區(qū)CpG島在特定的組織中保持非甲基化或低甲基化狀態(tài)，而使該類基因表達增加，進而參與細胞的生長發(fā)育，使細胞向特定的組織方向分化；而在其他組織中的該類基因則呈高甲基化狀態(tài)，表達受抑制。即轉(zhuǎn)錄活性基因呈去甲基化或低甲基化狀態(tài)，而非活性基因呈高甲基化狀態(tài)。許多非活性基因不能表達主要是由于啟動子區(qū)域的CpG島高度甲基化而不能啟動轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致基因沉默[17]。通常情況下，啟動子區(qū)的CpG島處于非甲基化狀態(tài)，基因能正常表達；當(dāng)其發(fā)生甲基化時，便影響基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，使基因表達沉默。因此，DNA甲基化與基因轉(zhuǎn)錄活性密切相關(guān)，一些抑癌基因由于啟動子的甲基化使該基因表達沉默或下調(diào)，因此在調(diào)控組織細胞的生長分化和腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[18]。另一方面，癌基因在腫瘤細胞中表達上調(diào)，與啟動子區(qū)低甲基化密切相關(guān)。越來越多的研究表明[19]，無論異常的DNA高甲基化還是低甲基化均可導(dǎo)致基因表達異常，從而促進腫瘤的發(fā)生。

5 腫瘤中DNMTs過度表達

大多數(shù)腫瘤細胞的DNMTs表達水平明顯高于正常細胞，并與抑癌基因啟動子高甲基化狀態(tài)相關(guān)，Jin等[20]研究發(fā)現(xiàn)，DNMT3b在大多數(shù)腫瘤細胞中過表達。曾宇等[21]采用RT-PCR技術(shù)檢測DNMT1，3a、3bmRNA在40例膀胱癌組織及正常膀胱組織中的表達結(jié)果顯示：膀胱癌組織中DNMT1、3b表達的陽性率均高于正常對照組，DNMT3a的表達率與正常對照組無明顯差異，三種基因的表達在不同腫瘤分級、分期、生長方式及原發(fā)腫瘤與復(fù)發(fā)腫瘤之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。DNMT1與DNMT3b表達值明顯相關(guān)，提示DNMT1、3b是膀胱癌形成、發(fā)展中的早期事件，可作為早期診斷和復(fù)發(fā)監(jiān)測的有效指標(biāo)，DNMT1和DNMT3b的表達可能存在共同調(diào)節(jié)機制。彭建新等[22]研究發(fā)現(xiàn)，肝癌組織中DNMT1，3a、3bmRNA顯著高于其在癌旁組織，肝硬化組織和慢性肝炎組織中的表達，DNMT1蛋白表達與腫瘤大小，數(shù)目，有無血管侵犯，TNM分期有關(guān)。

6 DNA甲基化與腫瘤的治療

Wnt通路在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用。SFRPs家族作為Wnt通路的重要拮抗劑，在結(jié)直腸癌細胞株及原發(fā)性結(jié)腸腫瘤樣本中均發(fā)現(xiàn)4個SFRP家族成員(SFRP1、2、4、5)存在高頻甲基化[23]，在胃癌，食管癌，肝癌，胰腺癌等其他消化道腫瘤中SFRPs基因也存在著不同程度的甲基化，且經(jīng)甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-氮雜胞苷處理后可恢復(fù)SFRPs的表達。Uhm等[24]檢測到在膽管癌細胞株中ID4、DLC-1、和SFRP1三種抑癌基因存在高度甲基化,而在非腫瘤組織及正常肝細胞株中檢出率低,用5-氮雜胞苷處理后這些基因表達上調(diào),這些結(jié)果不僅顯示DNA甲基化異常可能促進膽管癌的發(fā)生,而且也說明DNA甲基化抑制劑可以用于腫瘤的治療。Fan等[25]研究結(jié)果顯示聯(lián)合應(yīng)用組蛋白去乙?；敢种苿┖虳NMTs抑制劑可以恢復(fù)ER alpha陰性乳腺癌細胞株對內(nèi)分泌治療的敏感性。這些實驗研究證實了DNA甲基化抑制劑可以誘導(dǎo)腫瘤抑制基因的表達,它們將作為抗癌制劑在腫瘤治療中發(fā)揮重要作用。

由于高度甲基化而導(dǎo)致的抑癌基因轉(zhuǎn)錄失活并不改變基因本身的序列，因此從理論上說，恢復(fù)基因的正常甲基化狀態(tài)可以重新激活基因的功能，這為抗腫瘤藥物的設(shè)計提供了一個新的思路。DNMTs是DNA甲基化過程的關(guān)鍵酶。DNMTs抑制劑是通過抑制DNMTs活性、逆轉(zhuǎn)基因異常甲基化狀態(tài)，而達到抗癌效果的藥物。因此，DNMTs將有可能作為腫瘤治療的新靶點。目前已用于臨床試驗的主要是胞苷結(jié)構(gòu)類似物(5氮雜胞苷、5氮雜脫氧胞苷)，研究表明這類藥物具有恢復(fù)沉默基因活性、促進細胞分化等效果，但5氮雜脫氧胞苷具有較強的細胞毒性等不良反應(yīng)。DNMTs抑制劑類藥物及作用機理有待我們更深入研究。

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056001 河北省邯鄲市中心醫(yī)院血液腫瘤科

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