徐永富 方哲平 陳 霞 潘君芬 陳思思 蔣瓊英

肝內(nèi)膽管細(xì)胞型肝癌(intraheptic cholangiocarcinoma，ICC)是一種源于肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，約占原發(fā)性肝癌的5% ～15%，其惡性程度高，預(yù)后差，手術(shù)切除率遠(yuǎn)比肝細(xì)胞癌要低［1，2］。隨著對(duì)腫瘤研究的深入，發(fā)現(xiàn)人類白細(xì)胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，HLA-Ⅰ類分子表達(dá)下調(diào)可使腫瘤細(xì)胞逃避細(xì)胞毒性T 細(xì)胞的免疫識(shí)別，而非經(jīng)典HLA - Ⅰ類分子(HLA-E、G、F)作為免疫耐受分子，亦可幫助腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體免疫細(xì)胞(NK 細(xì)胞、T 細(xì)胞等)的識(shí)別與殺傷［3，4］。HLA-F 是新近發(fā)現(xiàn)的第3 種非經(jīng)典HLA-Ⅰ類分子，其基因多態(tài)性(HLA -F* 01:04)與肝癌的易感性有關(guān)，HLA-F 抗體存在于各種腫瘤患者(包括肝癌)的血清中，而且證實(shí)在肺、食管、胃等多部位腫瘤組織中存在HLA-F 異常表達(dá)［5～9］。

目前，國(guó)內(nèi)外尚未見到HLA-F 與ICC 的相關(guān)性報(bào)道，本研究中筆者利用免疫組化法檢測(cè)ICC 組織中HLA-F 的表達(dá)情況，并分析其與臨床病理因素的相關(guān)性，探討HLA-F 與ICC 發(fā)生、發(fā)展的內(nèi)在關(guān)系。

材料與方法

1.標(biāo)本來(lái)源:收集2003 年1 月～2012 年5 月在溫州醫(yī)科大學(xué)附屬浙江省臺(tái)州醫(yī)院接受手術(shù)治療的75 位ICC 患者的組織標(biāo)本(75 例ICC 癌灶組織及51 例鄰近正常組織)，術(shù)后均確診為肝內(nèi)膽管細(xì)胞型肝癌。腫瘤病理診斷參照世界衛(wèi)生組織標(biāo)準(zhǔn)、臨床分期標(biāo)準(zhǔn)參照美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)(AJCC)制定的第七版TNM 分期標(biāo)準(zhǔn)［10］。術(shù)前患者均未接受放化療或其他任何藥物干預(yù)。并有完整臨床病理資料(年齡、性別、病理診斷、被膜累及情況、血管/淋巴管浸潤(rùn)情況、腫瘤直徑、腫塊數(shù)目、TNM 分期等)。所有人體標(biāo)本的研究均事先獲得倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

2.免疫組織化學(xué)染色:石蠟包埋組織按照4μm 厚度進(jìn)行連續(xù)切片，所得石蠟切片常規(guī)脫蠟、梯度乙醇水化;3%H2O2孵育15min，消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性;高壓鍋熱處理5 ～8min 進(jìn)行抗原修復(fù);山羊血清孵育15min，消除非特異性抗體;滴加按照1∶300 稀釋后的兔抗人HLA -F 抗體14670 -1-AP(proteintec group，Chicago，IL，USA)，濕盒內(nèi)4℃孵育過(guò)夜;滴加山羊抗兔抗體(二抗，Dako，Glostrup，Denmark)，室溫孵育1h，PBS 沖洗;濃縮型DAB 顯微鏡下控制顯色;蘇木精復(fù)染，脫水，中性樹脂封片。皮膚癌組織用于陽(yáng)性對(duì)照，以PBS替代HLA-F 抗體作為陰性對(duì)照。

3.HLA-F 表達(dá)結(jié)果判定:陽(yáng)性細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕色或棕褐色顆粒，由2 名病理醫(yī)師進(jìn)行獨(dú)立雙盲半定量評(píng)估，取其平均值作為最終結(jié)果。切片內(nèi)染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占全部細(xì)胞5%以上標(biāo)記為HLA-F 表達(dá)陽(yáng)性，反之記為陰性。

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:采用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件，HLA -F 在癌灶組織和正常組織差異表達(dá)，以及其與各臨床病理因素的關(guān)系分析均采用Pearson χ2檢驗(yàn)，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.HLA-F 在ICC 癌灶組織中異常高表達(dá):細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕色或棕褐色染色產(chǎn)物定位為HLA-F 陽(yáng)性細(xì)胞，皮膚癌組織作為陽(yáng)性對(duì)照，以PBS 代替HLA-F 抗體作為陰性對(duì)照(圖1)。在肝癌癌灶組織中表達(dá)陽(yáng)性率為38.7%(29/75)，而鄰近正常組織不表達(dá)HLA-F(0/51)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=25.616，P ＜0.05)，癌灶組織HLA-F 表達(dá)升高。

圖1 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)HLA-F 表達(dá)

2.肝癌中HLA-F 的表達(dá)量與臨床病理參數(shù)的關(guān)系:為研究HLA-F 的臨床相關(guān)性，筆者分析了肝癌癌灶區(qū)HLA-F 表達(dá)量與各臨床病理因素的關(guān)系。數(shù)據(jù)顯示HLA - F 表達(dá)與腫瘤數(shù)目(χ2= 4.723，P =0.030)、血管/淋巴管浸潤(rùn)情況(χ2=5.476，P=0.019)相關(guān)，而與患者性別、年齡、被膜累及情況、腫瘤直徑、TNM 分期等無(wú)明顯相關(guān)。HLA-F 表達(dá)更多見于腫瘤多發(fā)或伴有血管/淋巴管浸潤(rùn)的ICC 患者(表1)。

討 論

本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，38.7%ICC 癌灶組織表達(dá)HLAF，而鄰近正常組織均無(wú)HLA-F 表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，HLA-F 在癌灶組織中表達(dá)升高。進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，癌灶區(qū)HLA-F 表達(dá)量和腫瘤數(shù)目、血管/淋巴管浸潤(rùn)等相關(guān);筆者由此推測(cè)，HLA -F 在ICC的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中可能發(fā)揮著重要的作用，并且有望成為ICC 的潛在診斷指標(biāo)之一。

1990 年，Geraghty 等［11］首次從B -LCL721.221細(xì)胞系中抽提出第3 個(gè)非經(jīng)典HLA -Ⅰ類分子(又稱為HLA-Ⅰb)，并命名為HLA -F，其基因位于人類6 號(hào)染色體短臂上，靠近著絲粒末端，全長(zhǎng)5.4kb。HLA-F 分子是一個(gè)β2-微球蛋白相關(guān)的(40 ～41)kDa 大小的、具有相對(duì)較低多態(tài)性的蛋白。HLA -F基因亦由8 個(gè)外顯子和7 個(gè)內(nèi)含子組成，但成熟的mRNA 缺乏外顯子7，導(dǎo)致其編碼的HLA -F 蛋白尾部較其他HLA -Ⅰ類分子短［11，12］。HLA -F 即可存在于胞內(nèi)，亦可表達(dá)于細(xì)胞膜表面。早期研究在細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)到了HLA -F 蛋白表達(dá)，Wainwright 等［13］利用一種針對(duì)HLA -F a1 結(jié)構(gòu)域的單克隆抗體，在外周血B 細(xì)胞，B 細(xì)胞株及含有B 細(xì)胞的組織(如成人扁桃體，嬰兒肝臟)中發(fā)現(xiàn)了其胞內(nèi)表達(dá);Lepin 等［14］利用HLA-F 蛋白和β2-m 重組蛋白作為免疫原產(chǎn)生抗體，用該抗體檢測(cè)發(fā)現(xiàn)扁桃體、脾臟及胸腺組織，和許多種組織及細(xì)胞株如膀胱、皮膚、肝臟細(xì)胞株等均有HLA-F 胞內(nèi)表達(dá)。后期研究發(fā)現(xiàn)，在侵入母體蛻膜的絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞、EB 病毒轉(zhuǎn)染的淋巴細(xì)胞株、以及活化后的B 細(xì)胞、T 細(xì)胞、NK 細(xì)胞、單核細(xì)胞等細(xì)胞表面均有HLA-F 表達(dá)［15～17］。

表1 ICC 癌灶區(qū)HLA-F 的表達(dá)量與臨床病理因素的關(guān)系［n(%)］

目前認(rèn)為HLA-F 主要功能是參與免疫調(diào)節(jié)，維持免疫耐受。Lepin 等［14］研究認(rèn)為，HLA -F 可能是通過(guò)結(jié)合抑制性受體(ILT2 和ILT4)發(fā)揮免疫抑制作用。而Lee 等［17］研究發(fā)現(xiàn)HLA -F 表面表達(dá)與淋巴細(xì)胞活化同步，可以作為免疫系統(tǒng)激活的標(biāo)志物，同時(shí)推測(cè)HLA-F 可作為信號(hào)分子，作用于調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞，引起機(jī)體的免疫耐受。Goodridge 等［18］發(fā)現(xiàn)HLA-F 可以介導(dǎo)外源蛋白的MHC -Ⅰ類分子交叉遞呈途徑，并且不依賴TAP 及tapasin，對(duì)溶酶體酶抑制劑敏感，揭示了該途徑對(duì)機(jī)體免疫調(diào)節(jié)和免疫防御的重要性，并且還分析了HLA -F 與MHC 分子的受體-配體關(guān)系，證實(shí)HLA-F 可以與NK 細(xì)胞和T 細(xì)胞上的殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體(KIR3DL2、KIR2DS4)結(jié)合，作為配體，調(diào)節(jié)其免疫活性［18，19］。HLA -F 對(duì)維持正常妊娠具有特殊意義，從免疫學(xué)觀點(diǎn)出發(fā)，胚胎是一個(gè)半異己的同種自然移植物，母體免疫系統(tǒng)中的免疫細(xì)胞能否識(shí)別并耐受胚胎抗原，直接影響妊娠的建立與維持，Shobu 等［20］發(fā)現(xiàn)HLA-F 參與了母胎耐受的建立，為胎兒生長(zhǎng)準(zhǔn)備適宜環(huán)境。當(dāng)HLA -F表達(dá)改變時(shí)，會(huì)引起T 細(xì)胞、NK 細(xì)胞自體免疫反應(yīng)，還導(dǎo)致各種免疫相關(guān)疾病，如呼吸道炎癥、皮膚潰瘍等［21］。而在腫瘤方面，我們?cè)缙谝延袑?shí)驗(yàn)研究了HLA- F 與非小細(xì)胞肺癌、食管鱗癌和胃癌的關(guān)系［7～9］:在肺癌組織中，24.1%(20/83)的癌灶組織表達(dá)HLA-F，但鄰近正常組織不表達(dá)HLA -F，而食管鱗癌癌灶組織和鄰近正常組織均有HLA-F 表達(dá)(陽(yáng)性率分別為58.1%、54.8%)，HLA -F 在胃癌組織中的陽(yáng)性率更是高達(dá)71.1%。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)HLA-F表達(dá)量和腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期等無(wú)明顯相關(guān)性，但HLA-F 表達(dá)改變與肺癌、食管癌患者的預(yù)后相關(guān)?？梢娔[瘤細(xì)胞亦可能通過(guò)高表達(dá)HLAF，躲避機(jī)體免疫系統(tǒng)的監(jiān)視，為其自身生長(zhǎng)創(chuàng)造良好環(huán)境，HLA-F 維持免疫耐受的功能也更好解釋并論證了我們的結(jié)論。同時(shí)，HLA-F 在上述3 種腫瘤組織中表現(xiàn)出不同的分布特點(diǎn)和臨床相關(guān)性，推測(cè)HLAF 因腫瘤類型差異可表現(xiàn)出不同的生物學(xué)行為特點(diǎn)。

總之，HLA -F 在ICC 癌灶中表達(dá)升高，且與腫瘤數(shù)目及血管/淋巴管浸潤(rùn)等有關(guān)，提示HLA -F 在ICC 的發(fā)生和發(fā)展中可能發(fā)揮了重要的作用，并可能成為ICC 潛在診斷指標(biāo)之一。HLA -F 的發(fā)現(xiàn)為腫瘤研究開啟了新的領(lǐng)域，HLA-F 與ICC 的關(guān)系仍需進(jìn)一步研究探索。

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