王菲菲 王 林 潘繼紅

乳腺癌發(fā)生率自20 世紀70 年代末開始一直呈上升趨勢。在我國，近年來由于人們生活方式、生活環(huán)境的改變，乳腺癌發(fā)生率的增長速度也迅速上升。迄今為止，乳腺癌的病因還未完全清楚，但是發(fā)病具有一定的規(guī)律性，其中許多研究表明，乳腺癌的發(fā)生與某些特定的基因密不可分［1，2］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，蛋白原轉(zhuǎn)化酶家族與癌癥的關系密切，其中furin 和PACE4 尤為重要，二者在腫瘤的增殖、遷移等過程中均發(fā)揮著重要的作用［3］。Cheng 等［4］已經(jīng)證實，與正常組織相比，PACE4 在乳腺癌中呈過表達。因此，本實驗借助RNA 干擾技術，以化學合成的siRNA 瞬時轉(zhuǎn)染人的乳腺癌MCF-7 細胞，通過qRT-PCR 以及Western blot 檢測基因沉默效率，篩選出特異性的siRNA，采用體外培養(yǎng)的方法觀察其對MCF -7 細胞的增殖能力和遷移能力以及細胞周期的影響。

材料與方法

1.試劑與材料:HiPerFect 轉(zhuǎn)染試劑(QIAGEN，德國)，胎牛血清(Hyclone，美國)，DMEM 培養(yǎng)基(Hyclone，美國)，兔抗人多克隆抗體ab39877(Abcom，美國)，RNA 提取試劑盒(OMEGA，美國)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TOYOBO，日本)，實時熒光定量PCR 試劑(Roche，德國)，3 -(4，5 -二甲基噻唑-2)-2 -二苯基四氮唑溴鹽、DMSO 均購自索萊寶公司，siRNA 和PACE4引物由上海吉瑪設計合成，人乳腺癌MCF -7 細胞株購自中科院上海細胞庫。

2.細胞的瞬時轉(zhuǎn)染:細胞培養(yǎng)于含10% 胎牛血清的DMEM 中，正常培養(yǎng)至80%融合時，加入胰酶消化，以3.0 ×105接種于24 孔板，按照HiPerFect 轉(zhuǎn)染試劑的說明書進行瞬時轉(zhuǎn)染，在24h 和36h 收集細胞。細胞分組:①siRNA-1 oligo干擾(1 -siPACE4)組;②siRNA -2 oligo 干擾(2 -siPACE4)組;③NC 組(陰性對照組);④MOCK 組(轉(zhuǎn)染試劑對照組)。

3.實時熒光定量PCR:采用RNA 提取試劑盒提取細胞RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒的方法將RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA 為模板進行PCR 擴增。Human GAPDH 作為內(nèi)參，進行標準化。反應條件為:95℃預變性5min，95℃變性10s，60℃退火10s，72℃延伸10s，反應40 個循環(huán)。以CT 法比較表達含量的表達變化。同時，產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，進一步驗證定量結果。實驗重復3 次。其中PACE4 引物設計:5' - AAGCAAGGGAAGTTGAAAGA-3'(上游引物)，5' - CACTGAAGGTGTGGTACG-3'(下游引物)，GAPDH 引物設計:5' -CACCATCTTCCAGGAGC - 3' (上游引物)，5' - AGTGGACTCCACGACGTA-3'(下游引物)。

4.蛋白水平檢測:采用Western blot 方法檢測:取轉(zhuǎn)染后細胞提取蛋白，利用Bradford 方法對蛋白定量，采用濕法轉(zhuǎn)膜將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF 膜上，脫脂奶粉封閉洗脫1h，加入兔抗人-PACE4 多克隆抗體，4℃過夜，洗膜后，加入二抗37℃孵育1h，增強型化學發(fā)光試劑(ECL)顯影、定影。

5.MTT 法檢測細胞增殖:細胞以3.0 ×104接種于96 孔板上，瞬時轉(zhuǎn)染，設置對照組，每組設置3 個重復孔，分別在轉(zhuǎn)染后24、36、48h 加入20μl MTT，避光培養(yǎng)4h 后吸出培養(yǎng)基MTT 混合物，加入150μl DMSO，室溫搖床放置10min，酶標儀上測定各孔A 值。

6.細胞遷移試驗:將處于對數(shù)生長期的細胞以8.0 ×104接種于24 孔板，細胞融合達到80%時，采用20μl 槍頭在孔中劃3 條平行線，用PBS 漂洗2 次去除劃下的懸浮細胞，瞬時轉(zhuǎn)染，繼續(xù)培養(yǎng)36h 后，倒置顯微鏡下分別觀察0h 和36h 時劃痕中細胞遷移情況。顯微鏡下任取5 個視野對進入劃痕中的細胞計數(shù)。實驗重復3 次。

7.流式細胞儀檢測細胞周期:將處于對數(shù)生長期的細胞以1.0 ×106接種于6 孔板，干擾過程同前。設置干擾組，陰性對照組和轉(zhuǎn)染試劑組。干擾24h 和36h 后按照周期試劑盒測定，使用BD 流式細胞儀，分析軟件，重復3 次試驗。

8.統(tǒng)計學方法:應用SPSS 17.0 統(tǒng)計分析軟件，結果以均數(shù)±標準差(±s)表示，多樣本間比較采用單因素方差分析，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1.siRNA 基因沉默對PACE4 基因的影響:(1)mRNA 水平:通過熒光定量PCR 對PACE4 的表達進行檢測，與對照組相比，PACE4 基因的2 -siRNA 的mRNA 在36h 抑制效果最明顯(圖1，P ＜0.01)。將36h 的qRT-PCR 結果進行瓊脂糖凝膠，結果如圖2，與上述結果一致。(2)蛋白水平:通過Western blot檢測轉(zhuǎn)染后PACE4 蛋白在MCF -7 細胞中的表達，結果顯示，在36h 時2 -siRNA 蛋白水平與對照組相比表達明顯降低，抑制效果最明顯，如圖3、圖4，此結果也與實時熒光定量PCR 結果一致。

圖1 siRNA 轉(zhuǎn)染MCF-7 細胞PACE4 mRNA 在24h 及36h 的相對表達水平

圖2 瓊脂糖凝膠電泳驗證siRNA 轉(zhuǎn)染乳腺癌MCF-7 細胞36h 時的PCR 結果

圖3 siRNA 轉(zhuǎn)染MCF-7 細胞24h 蛋白表達量

圖4 siRNA 轉(zhuǎn)染MCF-7 細胞36h 蛋白表達量

2.MTT 法檢測siRNA 對乳腺癌MCF -7 細胞增殖能力的影響:結果表明在轉(zhuǎn)染24、36和48h后，細胞的增殖速度與對照組相比明顯降低，且差距具有統(tǒng)計學意義(圖5，P ＜0.05)，結果也表明2 -siRNA在36h 的抑制效果最明顯。故挑選2 -siRNA 繼續(xù)進行以下實驗。

圖5 MTT 方法檢測siRNA 沉默PACE4 的表達對乳腺癌MCF-7 細胞增殖的影響

3.PACE4 siRNA 對MCF -7 細胞遷移能力的影響:采用細胞劃痕的方法對細胞遷移能力進行檢測，結果表明，在轉(zhuǎn)染36h 后，與0h 相比，沉默組細胞進入劃痕的細胞數(shù)明顯少于對照組，任取5 個視野對進入劃痕的細胞進行計數(shù)比較發(fā)現(xiàn)，處理組與對照組間差距具有統(tǒng)計學意義(圖6、圖7，P ＜0.05)。

4.PACE4 siRNA 對MCF-7 細胞周期的影響:利用流式細胞儀測定沉默PACE4 后對MCF -7 的作用，結果表明在24h 和36h，PACE4 的沉默對細胞周期的影響沒有統(tǒng)計學意義，如圖8 中A、B 所示。

圖6 細胞劃痕檢測siRNA 沉默PACE4 對乳腺癌MCF-7 細胞遷移能力的影響

討 論

乳腺癌的發(fā)生率已經(jīng)位居女性惡性腫瘤的首位。隨著篩查工作以及綜合治療的開展，乳腺癌已經(jīng)成為療效最佳的實體腫瘤之一，但是其病因的不確定性，使得對于乳腺癌的預防和治療仍需要得到人們的重視。目前對于乳腺癌的治療主要是放療、化療以及手術的方法，但是對于病患造成的傷害也是巨大的。隨著基因治療的不斷發(fā)展，分子靶向治療有望對于乳腺癌的治療提供新的希望。目前，在腫瘤的研究中，RNA 干擾技術已經(jīng)作為一種高度特異性沉默基因的方法被廣泛使用［5，6］。它的使用對腫瘤的基因研究，特別是作為對基因功能和基因治療等方面，以及體外實驗的順利進行提供了新的途徑。

圖7 細胞劃痕實驗36h 進入劃痕中的細胞

圖8 流式細胞儀測定siRNA 沉默PACE4 對MCF-7 細胞周期的影響

PACE4 是一種Ca2+依賴的枯草桿菌樣內(nèi)切蛋白酶，具有裂解偶合基本氨基酸序列的活性，其主要通過激活多種神經(jīng)肽類激素、生長因子、金屬蛋白酶類、膜結合蛋白及轉(zhuǎn)錄因子等來發(fā)揮其作用［7～10］。對腫瘤細胞的增殖、轉(zhuǎn)移等起著重要作用。PACE4 在不同類型的腫瘤中表達特點不同，Bassi 等［11］發(fā)現(xiàn)PACE4 在皮膚癌中呈現(xiàn)過表達，此后他們還證明了利用PACE4 抑制劑可以明顯降低癌細胞的增殖率和遷移率［12］。另外D'Anjou 等［13］發(fā)現(xiàn)在蛋白原轉(zhuǎn)化酶家族中，只有PACE4 在前列腺癌中過表達。然而PACE4 在卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌中都呈低表達［14～16］。

近年來隨著新的致病基因被不斷的發(fā)現(xiàn)和提出，人們對于乳腺癌易感基因的研究也進入了一個新階段［17］。本研究中利用siRNA 技術，合成靶向PACE4基因的siRNA，成功轉(zhuǎn)染MCF -7 細胞。特異性沉默PACE4 的表達，研究其對乳腺癌細胞的增殖、遷移以及細胞周期的影響。結果表明PACE4 基因的沉默，可以有效地降低細胞的增殖和遷移能力，沉默組與對照組相比差距都具有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)。后續(xù)筆者在不同的時間采用流式細胞儀對細胞周期進行測定發(fā)現(xiàn)，PACE4 的沉默對于細胞周期的影響沒有統(tǒng)計學意義，其原因為細胞是一個具有復雜功能的個體，其周期的影響涉及很多因素。

本研究初步表明，PACE4 在乳腺癌的增殖和遷移中起到了重要的作用，下調(diào)其表達可以明顯抑制乳腺癌細胞的增殖和遷移，但其具體的作用機制還需進一步的研究。近來我們實驗室利用基因芯片的方法對PACE4 的下游基因進行了一系列的篩查，正在努力找出在乳腺癌中與增殖和遷移相關的下游基因，對PACE4 的作用機制進一步探索。相信PACE4 有望作為乳腺癌基因治療的一個新的靶點，為新藥的開發(fā)提供一個新的依據(jù)。

1 Filippini SE，Vega A. Breast cancer genes:beyond BRCA1 and BRCA2［J］. Front Biosci (Landmark Ed)，2013，18:1358 -1372

2 Kuusisto KM，Bebel A，Vihinen M，et al. Screening for BRCA1，BRCA2，CHEK2，PALB2，BRIP1，RAD50，and CDH1 mutations in high-risk Finnish BRCA1/2 -founder mutation -negative breast and/or ovarian cancer individuals［J］.Breast Cancer Res，2011，13(1):R20

3 Bassi DE，Mahloogi H，Klein-Szanto AJ. The proprotein convertases furin and PACE4 play a significant role in tumor progression［J］. Mol Carcinog，2000，28(2):63 -69

4 Cheng M，Watson PH，Paterson JA，et al. Pro -protein convertase gene expression in human breast cancer［J］. Int J Cancer，1997，71(6):966 -971

5 Kanasty R，Dorkin JR，Vegas A，et al. Delivery materials for siRNA therapeutics［J］. Nat Mater，2013，12(11):967 -977

6 Bakhtiyari S，Haghani K，Basati G，et al. siRNA therapeutics in the treatment of diseases［J］. Ther Deliv，2013，4(1):45 -57

7 Nour N，Mayer G，Mort JS，et al. The cysteine-rich domain of the secreted proprotein convertases PC5A and PACE4 functions as a cell surface anchor and interacts with tissue inhibitors of metalloproteinases［J］. Mol Biol Cell，2005，16(11):5215 -5226

8 Scamuffa N，Calvo F，Chrétien M，et al. Proprotein convertases:lessons from knockouts［J］. FASEB J，2006，20(12):1954 -1963

9 Tsuji A，Kikuchi Y，Sato Y，et al. A proteomic approach reveals transient association of reticulocalbin - 3，a novel member of the CREC family，with the precursor of subtilisin-like proprotein convertase，PACE4［J］. Biochem J，2006，396(1):51 -59

10 Nagahama M，Taniguchi T，Hashimoto E，et al. Biosynthetic processing and quaternary interactions of proprotein convertase SPC4(PACE4)［J］. FEBS Lett，1998，434(1 -2):155 -159

11 Bassi DE，Lopez De Cicco R，Cenna J，et al. PACE4 expression in mouse basal keratinocytes results in basement membrane disruption and acceleration of tumor progression［J］. Cancer Res，2005，65(16):7310 -7319

12 Bassi DE，Zhang J，Cenna J，et al. Proprotein convertase inhibition results in decreased skin cell proliferation，tumorigenesis，and metastasis［J］. Neoplasia，2010，12(7):516 -526

13 D'Anjou F，Routhier S，Perreault JP，et al. Molecular validation of PACE4 as a target in prostate cancer［J］. Transl Oncol，2011，4(3):157 -172

14 Fu Y，Campbell EJ，Shepherd TG，et al. Epigenetic regulation of proprotein convertase PACE4 gene expression in human ovarian cancer cells［J］. Mol Cancer Res，2003，1(8):569 -576

15 Fu Y，Nachtigal MW. Nachtigal，Analysis of epigenetic alterations to proprotein convertase genes in disease［J］.MethodsMol Biol，2011，768:231 -245

16 Singh H，Heng S，Nicholls PK，et al. Proprotein convertases in post-menopausal endometrial cancer:distinctive regulation and non -invasive diagnosis［J］. Biochem Biophys Res Commun，2012，419(4):809 -814

17 Li S，Shen D，Shao J，et al. Endocrine - therapy - resistant ESR1 variants revealed by genomic characterization of breast -cancer -derived xenografts［J］. Cell Rep，2013，4(6):1116 -1130