徐 丹 曲 鵬 高 靜 崔 影

陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)是當(dāng)前研究特定基因表達(dá)調(diào)控及基因治療的重要技術(shù)之一，其優(yōu)越性主要表現(xiàn)在簡單、安全、毒性低、不限制所攜帶DNA 的大小、易大量制備等多個(gè)方面，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于各種原代細(xì)胞及細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染［1］。人外周血單核細(xì)胞是參與免疫炎癥反應(yīng)重要的功能細(xì)胞，是在醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究及臨床檢驗(yàn)中常用的一類細(xì)胞，目前國內(nèi)外關(guān)于人外周血單核細(xì)胞的轉(zhuǎn)染方法及轉(zhuǎn)染效率的報(bào)道相對較少。本研究組采用綠色熒光蛋白(greenfluorescent protein，GFP)作為報(bào)告基因，通過脂質(zhì)體Lipofectamine TM 2000 包裹A20 基因，體外轉(zhuǎn)染人外周血單核細(xì)胞，探討脂質(zhì)體介導(dǎo)A20 基因轉(zhuǎn)染人外周血單核細(xì)胞的可行性及最佳轉(zhuǎn)染條件，作為我們研究組的預(yù)實(shí)驗(yàn)，為外源性A20 基因后續(xù)體外及動(dòng)物干預(yù)試驗(yàn)研究奠定基礎(chǔ)。

材料與方法

1.材料:高效真核表達(dá)載體pCAGGS -GFP/A20 由比利時(shí)根特大學(xué)分子生物學(xué)系Dr K. Heyninck 和Prof. R. Beyaert提供;Lipofectamine TM 2000 轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen 公司;pCAGGS 質(zhì)粒、pCAGGS-GFP 質(zhì)粒、RT -PCR 試劑盒以及引物的設(shè)計(jì)、合成由寶生物工程(大連)有限公司構(gòu)建;胎牛血清購自中美合資蘭州民海生物工程有限公司;DMEM 培養(yǎng)基購自GIBCO 公司;Ficoll 細(xì)胞分離液購自上海普非生物有限公司。

2.技術(shù)路線:(1)Ficoll 淋巴細(xì)胞分離液分離正常人外周血單個(gè)核細(xì)胞。(2)pCAGGS -GFP/A20 重組質(zhì)粒的鑒定:將獲得的pCAGGS-GFP/A20 質(zhì)粒菌保涂Amp 抗性的平板后，過夜培養(yǎng)。挑單菌落于3ml Amp 抗性的LB 培養(yǎng)基中37℃搖床中過夜培養(yǎng)，集菌后，使用TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit 進(jìn)行小量質(zhì)粒提取，并使用EcoR Ⅴ/Sma Ⅰ進(jìn)行雙酶切鑒定，酶切產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳。(3)無內(nèi)毒素質(zhì)粒的大量提取:將鑒定好的pCAGGS -GFP/A20 質(zhì)粒菌保接種于100ml Amp 抗性的LB 培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)后，使用QIAGEN公司的Endo -Free Plasmid Maxi kit 進(jìn)行無內(nèi)毒素質(zhì)粒的提取，溶于試劑盒中的TE 緩沖液，并使用EcoR Ⅴ/Sma Ⅰ進(jìn)行雙酶切鑒定，酶切產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳。將質(zhì)粒DNA 提取物按適當(dāng)比例稀釋，置核酸濃度測定儀內(nèi)，測定DNA 濃度，并用真空濃縮機(jī)將質(zhì)粒濃度調(diào)整至1μg/μl。(4)pCAGGS -GFP/A20 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染條件的篩選:根據(jù)表1 及表2 對Lipofectamine TM 2000 轉(zhuǎn)染試劑和pCAGGS-GFP/A20 質(zhì)粒稀釋，分別取20μl 于稀釋的轉(zhuǎn)染試劑與25μl 稀釋質(zhì)粒的混合，在室溫保溫15min，然后將混合后的復(fù)合物加到24 孔板的細(xì)胞中，輕輕混勻。在孵箱中孵育5h，5h 后，棄去含有復(fù)合物的培養(yǎng)基，加入含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染48h 后在倒置熒光顯微鏡下觀察GFP 的表達(dá)情況，計(jì)算表達(dá)GFP 單核細(xì)胞數(shù)與所有細(xì)胞數(shù)的比值，多張片子多個(gè)角度取平均值，選取單核細(xì)胞GFP 表達(dá)強(qiáng)度最強(qiáng)，表達(dá)數(shù)量最多的一組確定最佳轉(zhuǎn)染條件，詳見圖1。(5)目的基因的檢測:將實(shí)驗(yàn)設(shè)A1 組(空白對照組);A2 組(轉(zhuǎn)染試劑組，培養(yǎng)液中加入Lipofectamine TM 2000 4μl，作用48h);A3 組(pCAGGS 組，轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒3μg 作用48h);A4 組(pCAGGS-GFP 組，轉(zhuǎn)染不含目的基因的質(zhì)粒3μg 作用48h);A5 組(pCAGGS-GFP/A20 組，轉(zhuǎn)染含有目的基因A20 的質(zhì)粒3μg 作用48h)，加入脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑及質(zhì)粒含量按篩選出的最佳轉(zhuǎn)染條件進(jìn)行，通過熒光顯微鏡檢測各組GFP 報(bào)告基因，RT-PCR 檢測目的基因A20 的表達(dá)。(6)反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT -PCR):PCR 引物及擴(kuò)增片段:外源性A20 引物:上游引物:5' - TTT GAG CAA TAT GCG GAA AGC -3';下游引物:5' -AGT TGT CCC ATT CGT CAT TCC-3'，擴(kuò)增片段長度319bp;β-actin 引物，上游引物:5' -AAC GAG CGG TTC CGA TGC CCT GAG -3'，下游引物:5' -TGT CGC CTT CAC CGT TCC AGT T-3'，擴(kuò)增片段長度為249bp;外源性A20 反應(yīng)條件:94℃5min，94℃50s，60℃58s，72℃60s，共進(jìn)行30 個(gè)循環(huán)，最后72℃8min。

圖1 pCAGGS-GFP/A20 質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑篩選比例

表1 Lipofectamine TM 2000 轉(zhuǎn)染試劑的稀釋方法(μl)

表2 質(zhì)粒的稀釋方法

結(jié) 果

1.pCAGGS-GFP/A20 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化:在倒置熒光顯微鏡下，以488nm 激發(fā)光波長激發(fā)熒光，察綠色熒光蛋白(green fluorescence protein，GFP)的表達(dá)，同一視野同時(shí)在熒光顯微鏡下及普通光鏡下觀察及攝片，計(jì)算表達(dá)GFP 細(xì)胞數(shù)與所有細(xì)胞數(shù)的比值，多張片子的多個(gè)視野取平均值，可見5C 孔表達(dá)最強(qiáng)，詳見圖2，即對于24 孔板的亞融合細(xì)胞來說，最佳脂質(zhì)體與質(zhì)粒的量之比為4μl∶3μg，確定了優(yōu)化條件后就可以根據(jù)培養(yǎng)板表面積線性放大，進(jìn)行本研究的干預(yù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 pCAGGS-GFP/A20 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染條件篩選結(jié)果

2.單核細(xì)胞轉(zhuǎn)染后GFP 表達(dá):熒光顯微鏡可見(圖3):A1 組(空白對照組)，A2 組(轉(zhuǎn)染試劑組)及A3 組(pCAGGS 組)單核細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)均未見GFP 表達(dá)，而A4 組(pCAGGS -GFP 組)，A5 組(pCAGGS -GFP/A20 組)，兩組單核細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)可見GFP 表達(dá)，提示真核表達(dá)載體pCAGGS 在單核細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染成功。

圖3 GFP 表達(dá)的特異性檢測結(jié)果(×400)

3. RT -PCR 檢測目的基因A20mRNA 表達(dá):外源性A20mRNA 與β -actin RT -PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳可見(圖4)，A1 組(空白對照組)、A2 組(轉(zhuǎn)染試劑組)、A3 組(pCAGGS 組)、A4 組(pCAGGS-GFP 組)各組均未檢測到外源性A20mRNA 的表達(dá)，而A5(pCAGGS -GFP/A20 組)組可檢測到目的基因A20mRNA 的表達(dá)，提示Lipofectamine TM 2000介導(dǎo)的pCAGGS -GFP/A20 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染可獲得目的基因A20 的表達(dá)。

討 論

圖4 外源性A20mRNA 與β-actinRT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖

新鮮分離的健康人外周血單核細(xì)胞是處于G0期、非分裂的原代細(xì)胞，這種細(xì)胞特性至少維持到體外分離后3 天以上，因此很難將外源基因?qū)雴魏思?xì)胞內(nèi)，并獲得高效表達(dá)［2，3］。作為真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)的優(yōu)越性主要表現(xiàn)在毒性低、對于所攜帶DNA 的大小無特殊要求、易大量制備等方面［4］。

更為重要的是，脂質(zhì)載體的免疫原性通常較低，允許在體內(nèi)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)時(shí)使用與體外實(shí)驗(yàn)相同的載體。陽離子脂質(zhì)體通過靜電作用與攜帶外源性目的基因的治療結(jié)合形成脂質(zhì)體復(fù)合物，然后被表面帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜吸附，再通過融合或細(xì)胞內(nèi)吞作用進(jìn)入溶酶體，內(nèi)吞后脂復(fù)合體在細(xì)胞內(nèi)形成的包涵體，在二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)作用下，細(xì)胞膜上的陰離子脂質(zhì)因膜的不穩(wěn)定而失去原有的平衡擴(kuò)散進(jìn)入復(fù)合體，與陽離子脂質(zhì)中的陽離子形成中性離子對，使原來與脂質(zhì)體結(jié)合的DNA 游離出來，進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，進(jìn)而通過核孔進(jìn)入細(xì)胞核，最終進(jìn)行轉(zhuǎn)錄并表達(dá)［5～7］。其轉(zhuǎn)染效率與脂質(zhì)體與DNA 的比例、細(xì)胞狀態(tài)、轉(zhuǎn)染時(shí)間以及靶細(xì)胞的選擇性作用有關(guān)。一般認(rèn)為，環(huán)狀DNA 的轉(zhuǎn)染效率高于線狀DNA，越小的基因其轉(zhuǎn)染效率越高［8～10］。

我們研究中應(yīng)用的目的基因A20 為比利時(shí)根特大學(xué)分子生物學(xué)教研室構(gòu)建的環(huán)狀DNA，根據(jù)本研究組后續(xù)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)需要，我們應(yīng)用了陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法對人外周血單核細(xì)胞進(jìn)行外源性基因A20的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，在本試驗(yàn)條件下，Lipofectamine TM 2000 轉(zhuǎn)染試劑與pCAGGS - GFP/A20 質(zhì)粒比例為4μl∶3μg 轉(zhuǎn)染效果最佳，研究中我們發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染試劑本身的毒性會(huì)對體外培養(yǎng)的人外周血單核細(xì)胞的生長狀態(tài)產(chǎn)生一定的影響，在轉(zhuǎn)染過程中需要更換新的培養(yǎng)基以降低轉(zhuǎn)染試劑對單核細(xì)胞的毒性，換液時(shí)間過早，脂質(zhì)體/DNA 復(fù)合物因不能有效被內(nèi)吞至胞體內(nèi)而導(dǎo)致轉(zhuǎn)染率相對較低，而換液時(shí)間過晚則會(huì)因?yàn)檗D(zhuǎn)染試劑的不良反應(yīng)影響細(xì)胞狀態(tài)，甚至?xí)?dǎo)致單核細(xì)胞活性降低，甚至是大量死亡，轉(zhuǎn)染效率也會(huì)降低在本試驗(yàn)條件下，當(dāng)轉(zhuǎn)染后5h 更換培養(yǎng)液可獲得相對較高的轉(zhuǎn)染效率。本實(shí)驗(yàn)作為研究組的預(yù)實(shí)驗(yàn)，通過陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法使得外源性A20基因在單核細(xì)胞獲得了瞬時(shí)表達(dá)，未進(jìn)行抗菌素的篩選。

本研究應(yīng)用陽離子脂質(zhì)體Lipofectamine TM 2000 介導(dǎo)外源性A20 基因轉(zhuǎn)染人外周血單核細(xì)胞，通過GFP 報(bào)告基因以及RT-PCR 檢測證實(shí)pCAGGS-GFP/A20 組轉(zhuǎn)染后經(jīng)培養(yǎng)至48h，獲得了A20 基因的表達(dá)，從而證實(shí)了表達(dá)載體pCAGGS-GFP/A20 的有效性，為外源性A20 基因干預(yù)單核細(xì)胞炎癥反應(yīng)的研究以及動(dòng)物干預(yù)實(shí)驗(yàn)打下良好基礎(chǔ)。

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