亓俊華 聶 剛 徐 祥 黃 宏 劉曉萍 王曉慧 吳 梅

瘢痕形成是高等哺乳動物創(chuàng)傷愈合的自然結(jié)局，但瘢痕異常增生則會導(dǎo)致病理性瘢痕產(chǎn)生［1］。病理性瘢痕是創(chuàng)面過度修復(fù)和組織纖維化的結(jié)果，增厚的瘢痕組織不僅嚴(yán)重影響美觀，而且后期較易發(fā)生攣縮導(dǎo)致組織或器官移位變形，引起不同程度的功能障礙［2］。病理性瘢痕包括增生性瘢痕和瘢痕疙瘩兩種，其形成主要是由于不同原因所引起成纖維細胞的異常增殖和膠原纖維大量合成，最終導(dǎo)致細胞外基質(zhì)中膠原成分過度沉積［4］。其中，成纖維細胞又被認(rèn)為是病理性瘢痕形成的關(guān)鍵效應(yīng)細胞［5］。對于病理性瘢痕的預(yù)防和治療一直是臨床上亟待解決的難題之一［3］。

本研究以病理性瘢痕形成和組織纖維化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)為突破口，試圖設(shè)計并合成可同時抑制Smad3(small mothers against decapentaplegic 3)和AP - 1(activator protein 1)兩種轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄活性的雙功能誘騙寡核苷酸轉(zhuǎn)染L929 成纖維細胞，競爭抑制活化AP-1 和Smad3 與啟動子區(qū)域的結(jié)合位點結(jié)合，進而抑制了L929 成纖維細胞的生長、增殖，旨在為進一步研發(fā)并制備治療病理性瘢痕和組織纖維化疾病的藥物奠定基礎(chǔ)。

材料與方法

1.材料:L929 成纖維細胞購自ATCC。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000(美國Invirtogen 公司)，96 孔酶聯(lián)板(美國Active Motif 公司的TransAMTMTranscription factor assay kits)，RPMI1640 培養(yǎng)基(Gibco 公司)，胎牛血清(杭州四季青公司)。D-Hanks、胰酶、TGF -β1、BSA(Hyclone 公司)。Fn抗體、TGF-β1 抗體、PAI -1 抗體、c -fos 抗體、Col1α2 抗體、CTGF 抗體和β-actin 抗體、二抗(Cell Signaling 公司)。隨機誘騙核苷酸序列、AP-1 陽性誘騙核苷酸序列、Smad3 陽性誘騙核苷酸序列及AP -1 和Smad3 雙功能誘騙核苷酸序列由華大基因合成

2.方法:(1)誘騙寡核苷酸的設(shè)計和合成:應(yīng)用美國PE公司391 型DNA 合成儀，以亞磷酰胺固相合成法合成所設(shè)計的硫代誘騙核苷酸。隨機誘騙寡核苷酸序列正義鏈:5' -GACGCAAGCAGTAGCTATTGCTCAGTCTACCATC - 3'，反 義鏈:5' - GATGGTAGACTGAGCAATAGCTACTGCTTGCGTC -3';AP-1 陽性對照誘騙寡核苷酸序列正義鏈:5' -GTGTCTGACTCATGTACTGTCTTACCTCATGTC -3'，反義鏈:5' - GACATGAGGTAAGACAGTACATGAGTCAGACAC -3';Smad3 陽性對照誘騙寡核苷酸序列正義鏈:5' -GTCTGAGCCAGACATAGTGATGCAGACATACTC-3'，反義鏈:5' - GAGTATGTCTGCATCACTATGTCTGGCTCAGAC-3';AP -1 和Smad3 雙功能誘騙寡核苷酸序列正義鏈:5' - GAGCCAGACATGAGTCATGTCTGCATTACCTCAC - 3'，反義鏈:5' - GTGA GGTAATGCAGACATGACTCATGTCTGGCTC-3'。以上序列全硫代修飾，由上海博亞公司合成并純化。各對鏈溶于無菌TE 溶液，分別退火形成雙鏈，4℃保存。(2)ELISA 法:提取細胞核抽提物，加入完全結(jié)合緩沖液中稀釋，然后依次加入96 孔酶聯(lián)板中混勻，室溫孵育1h。注以3 復(fù)孔進行各種樣品的檢測實驗分為:空白對照組、隨機誘騙核酸組、AP -1 陽性誘騙核酸組、Smad陽性誘騙核酸組和雙功能誘騙核酸組。以1∶500稀釋度稀釋c-fos 抗體或Smad3 抗體，后以100 微升/孔加入稀釋的抗體，室溫孵育1h;洗脫液洗滌;以1∶1000稀釋度稀釋羊抗兔IgG -HRP 二抗，后以100 微升/孔加入稀釋的二抗，室溫孵育1h;洗脫液洗滌4 次;以100 微升/孔加入底物反應(yīng)液，室溫孵育2～20min，待陽性對照液變深藍色后，以100 微升/孔加入終止液終止反應(yīng);于450nm 和655nm 雙波長檢測OD 值，然后計算競爭抑制率，抑制百分?jǐn)?shù)計算公式為:(空白對照OD-誘騙核酸OD)/空白對照OD。(3)細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染:L929 細胞為本實驗室凍存，速溶、離心、用含10%FBS 的RPMI 1640 培養(yǎng)基重懸，接種到培養(yǎng)瓶中，37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。次日換液，取對數(shù)生長期的細胞以2 ×104接種于96 孔板上，培養(yǎng)12h 后更換為無血清培養(yǎng)基，分別按照0.6 微升/孔脂質(zhì)體和終濃度為100nmol/L 的誘騙核苷酸的條件轉(zhuǎn)染L929 成纖維細胞。實驗分為以下幾組:正常對照組、TGF -β1 對照組、隨機誘騙核酸組、AP-1 陽性對照組、Smad3 陽性對照組和雙功能誘騙核酸組。(4)細胞計數(shù):96 孔板接種細胞，轉(zhuǎn)染5h后更換為完全培養(yǎng)基，除了正常對照組外，其他組同時加入終濃度為5ng/ml TGF - β1 誘導(dǎo)細胞增殖，培養(yǎng)72h 后各取3孔，0.25%胰酶消化，制成細胞懸液，血細胞計數(shù)板計數(shù)，每孔計數(shù)6 次。(5)ATP 生物熒光法:如上所述，培養(yǎng)72h 后每孔加入ATP 提取液100μl，混勻后室溫下放置30min，取50μl 細胞提取液于檢測板中，加入熒光素-熒光素酶50μl，混勻后置于熒光分析儀進行檢測，測定每孔樣品的熒光值。并計算細胞生長抑制率，作為誘騙核酸抑制L929 細胞增殖的評價指標(biāo)，細胞生長抑制率=(空白對照組熒光值-藥物組熒光值)/空白對照組熒光值。(6)免疫印跡實驗:將L929 細胞以1 ×105個/平板接種在6cm 平板中，轉(zhuǎn)染5h 后更換為完全培養(yǎng)基，除非誘導(dǎo)隨機誘騙核酸對照組外，其余同時加入終濃度5ng/ml 的TGF -β1 誘導(dǎo)細胞，在37℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)24h;收獲細胞，離心后重懸細胞，用細胞裂解液裂解細胞，抽提蛋白，并進行PAGE 電泳，用抗Fn 抗體(1∶1000)、抗TGF-β1 抗體(1∶1000)、抗PAI -1 抗體(1∶500)、抗c -fos 抗體(1∶500)、抗Col1α2 抗體(1∶1500)、抗CTGF 抗體(1∶2000)和抗β-actin 抗體(1∶2000)進行行免疫印跡實驗。

結(jié) 果

1.ELISA 法檢測誘騙核酸對AP -1/Smad3 與其順式作用元件結(jié)合的競爭抑制:與隨機誘騙核酸對照相比，雙功能誘騙藥物既能明顯抑制AP -1 的DNA結(jié)合活性，又能抑制Smad3 的DNA 結(jié)合活性(P ＜0.01)。然而AP-1 陽性對照核酸僅能抑制AP -1的DNA 的結(jié)合活性(P ＜0.01)，而對Smad3 的DNA結(jié)合活性則無抑制作用。于此相似，Smad3 陽性對照核酸僅能抑制Smad3 的DNA 結(jié)合活性(P ＜0.01)，而對AP-1 的DNA 結(jié)合活性則無抑制作用(圖1、圖2)。

2.誘騙核苷酸對L929 細胞數(shù)量的影響:TGF -β1 處理組于正常對照組相比細胞數(shù)量有所增加，但是和隨機誘騙核酸組相比沒有明顯的變化。與隨機誘騙寡核酸相比，AP -1、Smad3 陽性對照誘騙寡核酸處理組的細胞數(shù)量都有所減少(P ＜0.05)，其中雙功能誘騙核酸組的細胞數(shù)量相較于隨機誘騙核酸組降低更加明顯(P ＜0.01)，詳見圖3。

圖1 誘騙核酸對AP-1 DNA 結(jié)合活性的抑制作用

圖2 誘騙核酸對Smad3 DNA 結(jié)合活性的抑制作用

圖3 細胞計數(shù)檢測細胞數(shù)量

3.誘騙寡核苷酸對L929 細胞增殖的影響:隨機誘騙寡核酸相比，AP -1、Smad3 陽性對照誘騙寡核酸以及AP -1 和Smad3 雙功能誘騙寡核苷酸均對L929 細胞的生長均有明顯的抑制作用(P ＜0.01)，其中以AP-1 和Smad3 雙功能誘騙寡核苷酸的抑制作用最強(圖4)。

4.誘騙核酸對L929 細胞表達纖維化介質(zhì)的抑制作用:TGF - β1 能顯著誘導(dǎo)FN、PAI - 1、c - fos、Collα2、TGF-β1、CTGF 纖維化介質(zhì)的表達。與隨機誘騙核酸相比，AP -1、Smad3 陽性對照誘騙寡核酸以及AP-1 和Smad3 雙功能誘騙寡核苷酸均能顯著降低TGF-β1 誘導(dǎo)L929 細胞表達這些纖維化介質(zhì)的效應(yīng)，其中以AP -1 和Smad3 雙功能誘騙寡核苷酸的抑制作用最強(P ＜0.05，圖5)。

圖4 誘騙核酸對L929 細胞增殖抑制情況

圖5 Western blot 檢測L929 成纖維細胞纖維介質(zhì)的表達

討 論

Smad 信號通路和AP -1 信號通路是兩條與傷口愈合、瘢痕形成和組織纖維化關(guān)系最為密切的信號通路，它們的過度活化誘導(dǎo)了成纖維細胞的過度增殖，最終導(dǎo)致病理性瘢痕的形成［6］。Smad 信號通路主要參與TGF-β 誘導(dǎo)的應(yīng)答反應(yīng)，而AP-1 是傷口愈合和瘢痕形成過程中信號放大效應(yīng)的始動者，其可被TGF-β 活化，而活化的AP -1 又可上調(diào)TGF -β的表達，由此放大傷口愈合的信號［7～10］。

Decoy ODNs 指雙鏈的脫氧寡核苷酸，轉(zhuǎn)染入細胞，競爭性抑制轉(zhuǎn)錄因子與順式作用元件的結(jié)合，干擾轉(zhuǎn)錄因子的DNA 結(jié)合活性及其后續(xù)基因的表達［11］。由于該策略具有以下優(yōu)點:①潛在的藥物靶點(轉(zhuǎn)錄因子);②誘騙ODNs 的合成相對簡單且可靶向特異的組織;③不必弄清轉(zhuǎn)錄因子靶分子的精確分子結(jié)構(gòu);④誘騙ODNs 可阻斷與同一順式作用元件結(jié)合的多種轉(zhuǎn)錄因子的效應(yīng)，且也可阻斷同一轉(zhuǎn)錄因子所調(diào)控的多個靶基因的表達，其作用能力比反義ODNs 更強。因此國外眾多學(xué)者一致認(rèn)為該策略可作為治療某些人類疾病的一種有效的手段。目前，有關(guān)單獨靶向Smad 或者AP-1 的“誘騙”策略，已應(yīng)用于探討Smad 和AP-1 在癌癥、心血管和腎臟等相關(guān)疾病中的作用機制，以及對這些疾病的治療性研究，體外實驗和動物試驗結(jié)果已顯示出確切的結(jié)果。

本研究以傷口愈合和瘢痕形成相關(guān)基因調(diào)控的關(guān)鍵環(huán)節(jié)為突破口，應(yīng)用轉(zhuǎn)錄因子“誘騙”策略設(shè)計并合成可同時與Smad3 和AP -1 結(jié)合，并具有同時抑制兩種轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄活性的雙功能誘騙寡核苷酸。通過ELISA 方法檢測誘騙核酸對AP-1/Smad3 與其順式作用元件結(jié)合的競爭抑制作用。與隨機誘騙核酸對照相比，雙功能誘騙藥物既能明顯抑制AP -1的DNA 結(jié)合活性，又能抑制Smad3 的DNA 結(jié)合活性，而AP-1 陽性對照核酸僅能抑制AP -1 的DNA的結(jié)合活性，對Smad3 的DNA 結(jié)合活性則無抑制作用。與此相似，Smad3 陽性對照核酸僅能抑制Smad的DNA 結(jié)合活性，而對AP-1 的DNA 結(jié)合活性則無抑制作用。說明筆者設(shè)計合成的誘騙寡核苷酸是成功的。

筆者通過脂質(zhì)體介導(dǎo)的DNA 轉(zhuǎn)染技術(shù)將AP-1和Smad3 雙功能誘騙寡核苷酸和AP-1 陽性、Smad3陽性、Scramble 誘騙寡核苷酸序列導(dǎo)入了L929 成纖維細胞株內(nèi)，通過細胞計數(shù)檢測了細胞數(shù)量的變化同時也檢測了轉(zhuǎn)染后TGF-β1 誘導(dǎo)的細胞增殖率的變化，發(fā)現(xiàn)AP-1 和Smad3 雙功能誘騙寡核苷酸和AP-1 陽性、Smad3 陽性誘騙寡核苷酸組無論是細胞數(shù)量還是細胞增殖抑制率明顯高于Scramble 組，其中以AP -1 和Smad3 雙功能誘騙寡核苷酸組最為明顯，增殖抑制率高達70%。

在L929 成纖維細胞中持續(xù)活化的AP - 1 和Smad3 雙功能誘騙寡核苷酸組和AP -1 陽性、Smad3陽性誘騙寡核苷酸組是通過下調(diào)纖維介質(zhì)的表達來抑制細胞的增殖［12～15］。本實驗在蛋白水平上檢測了相關(guān)纖維介質(zhì)的表達情況，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染AP-1 和Smad3雙功能誘騙寡核苷酸組和AP -1 陽性、Smad3 陽性組與Scramble 組相比FN、PAI-1、c-fos、Collα2、TGF-β1、CTGF 等纖維化介質(zhì)的表達均受到高效抑制，但AP-1 和Smad3 雙功能誘騙寡核苷酸組的抑制作用更強。而未用TGF -β1 誘導(dǎo)和TGF -β1 誘導(dǎo)的細胞同時轉(zhuǎn)染Scramble 誘騙寡核苷酸，明顯的看到TGF-β1 誘導(dǎo)組FN、PAI -1、c -fos、Collα2、TGF -β1、CTGF 等纖維化介質(zhì)的表達明顯增高。通過本研究初步證實這種雙功能誘騙寡核苷酸可以減少細胞數(shù)量并且可以高效抑制FN、PAI -1、c -fos、Collα2、TGF- β1、CTGF 等纖維化介質(zhì)的表達，從而抑制L929 成纖維細胞的生長、增殖。

目前，同時針對Smad3 和AP -1 這兩條信號通路的抑制劑國內(nèi)外均未見報道。本研究應(yīng)用轉(zhuǎn)錄因子“誘騙”策略設(shè)計并合成了Smad3 和AP-1 雙重抑制劑，并證實其能高效抑制L929 成纖維細胞的生長、增殖，為進一步研發(fā)并制備高效抗病理性瘢痕和組織纖維化的藥物奠定了理論基礎(chǔ)。

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