戴紅良， 賈桂枝， 劉 堃， 梁春光， 張 林， 張志剛， 王洪新

(遼寧醫(yī)學(xué)院1護(hù)理學(xué)院，2生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，4藥理學(xué)教研室，遼寧錦州121001;3聊城市人民醫(yī)院藥學(xué)部，山東聊城252600)

氧化應(yīng)激在缺血再灌注損傷、高血壓、糖尿病等疾病所致心肌損害中具有重要作用。異常的氧化應(yīng)激水平可誘發(fā)炎癥反應(yīng)，引起細(xì)胞凋亡增加，最終引起心肌重構(gòu)及充血性心力衰竭［1-2］。鑒于此，阻止氧化應(yīng)激和對(duì)抗細(xì)胞凋亡為臨床治療各種心血管疾病提供了重要思路。左卡尼汀又稱(chēng)左旋肉堿，其基本功能是將長(zhǎng)鏈脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體機(jī)制，促進(jìn)其氧化分解，是哺乳動(dòng)物體內(nèi)參與能量代謝的重要物質(zhì)［3］。除此之外，左卡尼汀還具有顯著的抗氧化及抗凋亡活性［4］。我們最近的研究也發(fā)現(xiàn)左卡尼汀能夠顯著抑制由過(guò)氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)刺激引起的體外心肌細(xì)胞凋亡［5］，然而對(duì)于其確切機(jī)制卻知之甚少。本研究擬在我們前期研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討左卡尼汀的抗凋亡作用機(jī)制。

材料和方法

1 材料

1．1 藥物與試劑 胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料研究所;胰蛋白酶、DMEM低糖培養(yǎng)基、二甲基亞砜、MTT、左卡尼汀、1，2-雙(2-氨基苯氧基)乙烷-N，N，N'，N'-四乙酸［1，2-bis(2-aminophenoxy)ethane-N，N，N'，N'-tetraacetic acid，BAPTA］及KN93均購(gòu)于Sigma;annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京寶賽生物技術(shù)有限公司;Fluo-3/AM購(gòu)自江蘇碧云天;牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)蛋白定量試劑盒購(gòu)自Pierce;cleaved caspase-3 I抗購(gòu)于Cell Signaling;鈣調(diào)素依賴(lài)蛋白激酶II(calmodulin-dependent protein kinase II，CaMKII)I 抗購(gòu)自Santa Cruz;磷酸化 CaMKⅡ (phospho-CaMKⅡ，p-CaMKⅡ)購(gòu)自 Promega;甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)I抗購(gòu)于Sigma;辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxide，HRP)標(biāo)記的II抗購(gòu)于Santa Cruz。

1．2 動(dòng)物 出生1～3 d Sprague-Dawley(SD)大鼠乳鼠，雌雄不拘，由遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物合格證號(hào)為SCXK(遼)2003-0007。

2 方法

2．1 心肌細(xì)胞培養(yǎng) 新生大鼠心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)方法，參照文獻(xiàn)［5］。取出生1～3 d SD大鼠乳鼠，開(kāi)胸取出心臟，用D-Hanks液沖洗3次后剪成約1 mm×1 mm×1 mm大小的碎塊，在37℃條件下，以0．8 g/L胰蛋白酶消化分離細(xì)胞。將消化完畢的細(xì)胞以差速貼壁法進(jìn)行純化后，置于含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合后，換以含0．04%胎牛血清的DMEM，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，將細(xì)胞分組用于實(shí)驗(yàn)。

2．2 實(shí)驗(yàn)分組 將體外培養(yǎng)的SD大鼠心肌細(xì)胞隨機(jī)分為正常對(duì)照組、H2O2處理組、左卡尼汀(1．2 mmol/L)+H2O2組、BAPTA(細(xì)胞內(nèi)鈣離子絡(luò)合劑，20μmol/L)+H2O2組和KN93(CaMKII特異性抑制劑，0．2 μmol/L)+H2O2組。H2O2濃度為200 μmol/L，作用時(shí)間為12 h。左卡尼汀于加入H2O21 h前加入，BAPTA及KN93于加入H2O230 min前加入。左卡尼汀、BAPTA及KN93均維持至H2O2處理結(jié)束。

2．3 心肌細(xì)胞活力檢測(cè) 采用MTT法測(cè)定心肌細(xì)胞活力。將接種于96孔培養(yǎng)板，處理完畢后的心肌細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。在測(cè)試前4 h，每孔加入0．5 g/L MTT，于CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄去培養(yǎng)液，每孔加入二甲基亞砜100μL，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。選擇570 nm波長(zhǎng)，在酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔吸光度(A)，該值間接反映細(xì)胞活力的高低。

2．4 心肌細(xì)胞凋亡測(cè)定 采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，將經(jīng)過(guò)處理的心肌細(xì)胞用1．25 g/L胰蛋白酶消化分離，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為1×109/L后，按照annexin V-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

2．5 心肌細(xì)胞內(nèi)靜息鈣濃度(［Ca2+］i)測(cè)定 細(xì)胞用D-Hanks液洗3次，用5μmol/L Fluo-3/AM 37℃避光孵育45 min，然后吸出染液，再以D-Hanks液洗滌3次，每孔加入0．5 mL D-Hanks液。將激光共聚焦顯微鏡專(zhuān)用培養(yǎng)皿置于LSCM 570載物臺(tái)上，激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)525 nm，記錄細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度并由計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行處理。以細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度間接反映細(xì)胞內(nèi)靜息鈣離子水平。指定對(duì)照組熒光強(qiáng)度為1，以其它組與對(duì)照組的比值反映各組的相對(duì)熒光強(qiáng)度。

2．6 Cleaved caspase-3和 p-CaMKII表達(dá) 收集細(xì)胞，加細(xì)胞裂解液 RIPA［1%乙基苯基聚乙二醇(nonidet P-40，NP-40)，0．5% 脫氧膽酸鈉，1% 十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)，0．1% 苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)］提取細(xì)胞總蛋白，二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)法測(cè)定蛋白濃度。取50μg總蛋白，以1×樣品緩沖液配平上樣體積，沸水煮5 min后置10%SDSPAGE中進(jìn)行電泳，待電泳完成后電轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜。用5%脫脂牛奶封閉1 h，接著加 cleaved caspase-3、p-CaMKII、CaMKII及GAPDHⅠ抗4℃孵育過(guò)夜。TBS-T充分洗膜后，以HRP標(biāo)記的Ⅱ抗室溫孵育2 h。TBS-T洗膜后，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(enhanced chemiluminescence，ECL)顯色。用ImageJ 1．42軟件對(duì)掃描的條帶進(jìn)行灰度分析。指定對(duì)照組蛋白表達(dá)為1，以其它組與對(duì)照組的比值反映各組的相對(duì)蛋白表達(dá)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13．0統(tǒng)計(jì)軟件分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。組間比較采用單因素方差分析。以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 左卡尼汀、BAPTA及KN93對(duì)大鼠心肌細(xì)胞活力的影響

與正常組比較，H2O2組大鼠心肌細(xì)胞活力顯著降低。而與模型組比較，左卡尼汀、BAPTA及KN93預(yù)處理組心肌細(xì)胞活力則顯著增加，見(jiàn)圖1。

2 左卡尼汀、BAPTA及KN93對(duì)大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，H2O2處理12 h后大鼠心肌細(xì)胞凋亡顯著增加。與H2O2組相比左卡尼汀、BAPTA及KN93預(yù)處理組心肌細(xì)胞凋亡率均顯著降低;利用Western blotting檢測(cè)cleaved caspase-3(代表凋亡執(zhí)行蛋白caspase-3的活性)的表達(dá)，也得到了類(lèi)似的結(jié)果，見(jiàn)圖2、3。

Figure 1．Effects of L-carnitine，BAPTA and KN93 on decreased cell viability induced by H2O2 in rat cardiomyocyte．Mean±SD．n=6．*P ＜0．05 vs control;#P ＜0．05 vs H2 O2 alone．圖1 左卡尼汀、BAPTA及KN93對(duì)H 2 O 2誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞活力降低的影響

Figure 2．Effects of L-carnitine，BAPTA and KN93 on H2 O2-triggered apoptosis of rat cardiomyocytes．Mean ± SD．n=5．*P ＜0．05 vs control;#P ＜0．05 vs H2O2 alone．圖2 左卡尼汀、BAPTA及KN93對(duì)H 2 O2誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響

Figure 3．Effects of L-carnitine，BAPTA and KN93 on H2O2-triggered caspase-3 activation in rat cardiomyocytes．Mean±SD．n=3．*P ＜0．05 vs control;#P＜0．05 vs H2 O2 alone．圖3 左卡尼汀、BAPTA及KN93對(duì)H 2O2誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)caspase-3活化的影響

3 左卡尼汀、BAPTA及KN93對(duì)大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)靜息鈣的影響

與正常組比較，H2O2處理12 h后大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)靜息鈣離子水平顯著增加。左卡尼汀和BAPTA均能顯著降低H2O2處理組心肌細(xì)胞內(nèi)的靜息鈣水平。而KN93對(duì)H2O2誘導(dǎo)的靜息鈣增加無(wú)顯著影響，見(jiàn)圖4。

Figure 4．Effects of L-carnitine，BAPTA and KN93 on H2O2-triggered elevation of resting intracellular free calcium concentration(［Ca2+］i)in rat cardiomyocytes．Mean±SD．n=120．*P ＜0．05 vs control;#P ＜0.05 vs H2O2 alone．圖4 左卡尼汀、BAPTA及KN93對(duì)H 2 O2誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)靜息鈣升高的影響

4 左卡尼汀、BAPTA及KN93對(duì)大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)CaMKII磷酸化的影響

與正常組比較，H2O2處理12 h后大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)磷酸化CaMKII(p-CaMKII)水平顯著升高。左卡尼汀、BAPTA及KN93預(yù)處理不同程度抑制CaMKII的磷酸化，見(jiàn)圖5。

Figure 5．Effects of L-carnitine，BAPTA and KN93 on H2 O2-triggered CaMKII activation in rat cardiomyocytes．Mean±SD．n=3．*P ＜0．05 vs control;#P ＜0．05 vs H2 O2 alone．圖5 左卡尼汀、BAPTA及KN93對(duì)H 2 O 2誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)CaMKII活化的影響

討 論

氧化應(yīng)激系指細(xì)胞中的促氧化與抗氧化系統(tǒng)失衡，導(dǎo)致氧化作用過(guò)度增強(qiáng)而引起的一種細(xì)胞內(nèi)的紊亂狀態(tài)。心肌受到損傷后，活性氧與自由基生成大大增加。已經(jīng)證實(shí)，氧化應(yīng)激在心肌缺血再灌注損傷、充血性心力衰竭及乙醛中毒等病理過(guò)程中發(fā)生的細(xì)胞凋亡有著密不可分的關(guān)系［6-8］。而應(yīng)用抗氧化劑往往能夠抑制該過(guò)程［9］。

左卡尼汀具有顯著的抗氧化活性。我們之前的研究也發(fā)現(xiàn)左卡尼汀能顯著改善活性氧物質(zhì)H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激及凋亡。利用鈣瞬變技術(shù)，我們認(rèn)為該抗凋亡作用可能與左卡尼汀改善細(xì)胞內(nèi)的鈣紊亂有關(guān)［5］。由于上述鈣離子測(cè)定是在急性條件下進(jìn)行的(H2O2最長(zhǎng)刺激5 min)，用其解釋慢性刺激后的凋亡尚具有一定的局限性。為此，為進(jìn)一步證實(shí)左卡尼汀的抗凋亡活性確實(shí)與其抑制細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載有關(guān)，我們?cè)诒緦?shí)驗(yàn)中運(yùn)用了激光共聚焦技術(shù)，同步測(cè)量細(xì)胞凋亡與細(xì)胞內(nèi)靜息Ca2+濃度(H2O2刺激12 h)。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，BAPTA(Ca2+螯合劑)預(yù)處理可明顯抑制H2O2刺激誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，表明Ca2+超載是H2O2誘發(fā)心肌細(xì)胞凋亡的重要機(jī)制。而左卡尼汀在抑制細(xì)胞凋亡的同時(shí)，還可顯著降低心肌細(xì)胞內(nèi)的靜息鈣水平。充分說(shuō)明，糾正心肌細(xì)胞內(nèi)鈣超載是左卡尼汀發(fā)揮其抗H2O2所致細(xì)胞凋亡的重要機(jī)制。

作為細(xì)胞內(nèi)重要的鈣離子調(diào)節(jié)蛋白，CaMKII活化在心肌細(xì)胞凋亡中起著至關(guān)重要的作用［10］。在本實(shí)驗(yàn)中用特異性抑制劑KN93阻斷CaMKII后，H2O2誘發(fā)心肌細(xì)胞凋亡明顯降低。說(shuō)明CaMKII活化也參與了H2O2誘導(dǎo)的心肌凋亡。而且，左卡尼汀預(yù)處理能顯著降低CaMKII的磷酸化(活化)，表明左卡尼汀的抗凋亡活性可能與其抑制CaMKII的活化有關(guān)。

目前共發(fā)現(xiàn)α、β、γ及δ亞型的CaMKII，而心肌中最主要的類(lèi)型屬δ亞型［10］。而且在δ亞型的13種剪接變異體中，只有 δB和 δC在心肌中表達(dá)［11］。雖然在本研究中我們不能確定是δ亞型哪個(gè)變異體參與了H2O2誘導(dǎo)的凋亡。但已有研究提示，在氧化應(yīng)激時(shí)，δB和δC心肌中起著截然相反的作用:δB抑制凋亡，而δC則促進(jìn)凋亡［12］。所以很可能是 δC活化介導(dǎo)了H2O2誘導(dǎo)的心肌凋亡。

總之，本研究證實(shí)左卡尼汀對(duì)H2O2誘發(fā)心肌細(xì)胞凋亡具有顯著的抑制作用，其作用機(jī)制可能與其減輕細(xì)胞內(nèi)鈣超載和抑制CaMKII活化有關(guān)。