范珊珊， 賀紅焰， 夏紀(jì)毅， 陳 楓， 張奉蓮， 劉 建△

(瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院1腎病內(nèi)科，2病理教研室，3分子與免疫研究室，四川瀘州646000)

腎素－血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)與腎臟纖維化密切相關(guān)。血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)作為RAS的主要生物活性肽，主要通過(guò)作用于AngⅡ1型受體(AngⅡ type 1 receptor，AT1受體)促進(jìn)多種致纖維化細(xì)胞因子及炎癥因子的合成分泌，引起細(xì)胞外基質(zhì)(extra cellular matrix，ECM)生成增多、積聚，參與腎臟纖維化的發(fā)生發(fā)展［1］。血管緊張素-(1-7)［angiotensin-(1-7)，Ang-(1-7)］是近年來(lái)研究較多的RAS新成員，具有拮抗AngⅡ、擴(kuò)血管、調(diào)節(jié)水鈉、抗氧化及抗增殖等作用［2］。我們的前期研究亦證實(shí)Ang-(1-7)能夠拮抗AngⅡ誘導(dǎo)的大鼠腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞活化，減少ECM的合成［3］。近年來(lái)，大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為Ang-(1-7)與G蛋白偶聯(lián)受體Mas結(jié)合發(fā)揮主要作用，已有體外研究發(fā)現(xiàn)Ang-(1-7)可抑制AngⅡ誘導(dǎo)的大鼠近曲小管細(xì)胞的增殖及細(xì)胞外基質(zhì)的分泌，而該作用可被Mas受體拮抗劑D-Ala(7)-Ang-1-7所阻斷［4］。但亦有研究顯示Ang-(1-7)可能存在其它非Mas受體［5］。目前，對(duì)于Ang-(1-7)是否通過(guò)與Mas受體結(jié)合發(fā)揮拮抗AngⅡ誘導(dǎo)腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞活化的作用尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。本研究將體外培養(yǎng)大鼠腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞，觀察Mas表達(dá)抑制后對(duì)Ang-(1-7)拮抗AngⅡ誘導(dǎo)腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞活化的影響，了解Mas受體在其中的作用，為臨床治療腎臟纖維化提供進(jìn)一步的理論依據(jù)。

材料和方法

1 材料

大鼠腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞株NRK-49F由四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)院惠贈(zèng);RNA提取試劑盒(北京天根);RTPCR試劑盒(大連寶生物);HiPerFect Transfection Reagent(Qiagen);Mas抗體(Santa Cruz);Ⅰ型膠原(collagenⅠ，ColⅠ)檢測(cè) ELISA 試劑盒(R＆D);Ang-(1-7)、AngⅡ和抗α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)抗體(Sigma);免疫組織化學(xué)試劑盒(北京中杉金橋);siRNA由上海吉瑪公司設(shè)計(jì)合成。Mas siRNA序列 1正義鏈 5’-CC UGACCAGAGCUUUCAAATT-3’， 反 義 鏈 5’-UUUGAAAGCUCUGGUCAGGTT-3’;序列 2 正義鏈 5’-GACCAAUCAAAUAUGACAUTT-3’，反義鏈 5’-AUGUCAUAUUUGAUUGGUCTT-3’;序列 3 正義鏈 5’-GCCAUUACUACACAAUCGUTT-3’，反義鏈 5’-ACG AUUGUGUAGUAAUGGCTT-3’;陰性序列正義鏈 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’，反 義 鏈 5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’。

2 方法

2．1 細(xì)胞培養(yǎng) 復(fù)蘇NRK-49F，采用含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NRK-49F細(xì)胞稀釋成1×108/L細(xì)胞懸液用于實(shí)驗(yàn)。

2．2 有效Mas siRNA的篩選

2．2．1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將細(xì)胞接種至6孔板上，實(shí)驗(yàn)分組:(1)Mas siRNA-1組:加入含Mas siRNA序列1的轉(zhuǎn)染液;(2)Mas siRNA-2組:加入含siRNA序列2的轉(zhuǎn)染液;(3)Mas siRNA-3組:加入含siRNA序列3的轉(zhuǎn)染液;(4)陰性對(duì)照組:加入含siRNA陰性序列的轉(zhuǎn)染液;(5)正常對(duì)照組:只加入轉(zhuǎn)染試劑;轉(zhuǎn)染步驟參照HiPerFect Transfection Reagent說(shuō)明書進(jìn)行，并對(duì)siRNA和轉(zhuǎn)染試劑用量進(jìn)行優(yōu)化，每孔加入siRNA 1×10－5mol/L和HiPerFect Transfection Reagent 12μL，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，轉(zhuǎn)染后48 h檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。

2．2．2 RT-PCR 檢測(cè) Mas mRNA 用 Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，以GAPDH作內(nèi)參照，參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。Mas上游引物5’-GTGGTGAAGATACGGAAGA-3’，下游引物 5’-GCTGCTATTGATGGTGGA-3’，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為 192 bp;GAPDH上游引物 5’-CCTCAAGATTGTCAGCAAT-3’，下游引物 5’-CCATCCACAGTCTTCTGAGT-3’，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為141 bp。將逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行PCR，擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性5 min，94℃ 30 s，53℃ 30 s，72℃ 1 min，共30個(gè)循環(huán)，72℃ 5 min。電泳后，以Mas和內(nèi)參照電泳條帶的吸光度比值作為各組Mas mRNA表達(dá)的比較。

2．2．3 Western blotting檢測(cè)Mas蛋白 加入細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，置冰上10 min后4℃ 15 000 r/min離心5 min，收集上清液，即為提取的蛋白。經(jīng)12%聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離后電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，Ⅰ抗4℃孵育過(guò)夜，Ⅱ抗室溫孵育1 h。加入化學(xué)發(fā)光劑顯影曝光后，采用 Quantity One 4．4．0軟件測(cè)灰度值，分析結(jié)果。

2．3 有效Mas siRNA對(duì)Ang-(1-7)拮抗AngⅡ的影響

2．3．1 實(shí)驗(yàn)分組 按不同的干預(yù)因素分6組:(1)正常對(duì)照組:僅加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基;(2)AngⅡ組:培養(yǎng)基中加入AngⅡ;(3)Ang-(1-7)組:培養(yǎng)基中加入Ang-(1-7);(4)Ang-(1-7)+AngⅡ組:同時(shí)加入 AngⅡ和 Ang-(1-7);(5)陰性siRNA對(duì)照組［Ang II+Ang-(1-7)+negative siRNA］:陰性siRNA轉(zhuǎn)染48 h后加入AngⅡ和Ang-(1-7);(6)Mas siRNA轉(zhuǎn)染組［Ang II+Ang-(1-7)+Mas siRNA-2］:Mas siRNA序列2轉(zhuǎn)染48 h后加入 AngⅡ和Ang-(1-7)。上述各組中AngⅡ終濃度均為1×10－6mol/L，Ang-(1-7)的終濃度均為1 ×10－5mol/L。

2．3．2 細(xì)胞免疫化學(xué)法檢測(cè)α-SMA 將上述分組加入藥物干預(yù)72 h后，取出6孔板中細(xì)胞爬片，4%多聚甲醛固定10 min，0．1%Triton X-100處理30 min，之后操作按免疫組織化學(xué)染色試劑盒說(shuō)明書要求進(jìn)行，DAB顯色后封片，倒置顯微鏡下觀察陽(yáng)性信號(hào)，照相。

2．3．3 ELISA法檢測(cè)ColⅠ 將上述分組加入藥物干預(yù)72 h后，收集細(xì)胞上清液，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，操作按ColⅠ-ELISA試劑盒說(shuō)明書，于波長(zhǎng)450 nm的全光譜分光光度計(jì)上讀取吸光度，取均數(shù)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，使用SPSS 11．5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 RT-PCR結(jié)果

轉(zhuǎn)染后48 h，RT-PCR結(jié)果顯示，陰性對(duì)照組與正常對(duì)照組Mas mRNA表達(dá)無(wú)明顯差異(P＞0.05);各轉(zhuǎn)染組與正常對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，Mas mRNA表達(dá)均下降，其中以Mas siRNA-2組下降最明顯(P ＜0.05)，見(jiàn)圖1。

2 Western blotting結(jié)果

轉(zhuǎn)染后48 h，Western blotting結(jié)果顯示，陰性對(duì)照組與正常對(duì)照組Mas蛋白表達(dá)無(wú)明顯差異(P＞0.05);各轉(zhuǎn)染組與正常對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，Mas蛋白表達(dá)均下降，其中以Mas siRNA-2組下降最明顯(P ＜0.05)，見(jiàn)圖2。

Figure 1．Expression of Mas mRNA in NRK-49F cells measured by RT-PCR．M:DNA marker．1:Mas siRNA-1;2:Mas siRNA-2;3:Mas siRNA-3;4:negative siRNA;5:normal control．Mean ± SD．n=3．*P ＜ 0.05 vs other groups．圖1 RT-PCR 檢測(cè)細(xì)胞Mas mRNA的表達(dá)

Figure 2．Expression of Mas protein in NRK-49F cells measured by Western blotting．1:Mas siRNA-1;2:Mas siRNA-2;3:Mas siRNA-3;4:negative siRNA;5:normal control．Mean ± SD．n=3．*P ＜0.05 vs other groups．圖2 Western blotting檢測(cè)細(xì)胞Mas蛋白的表達(dá)

3 細(xì)胞免疫化學(xué)結(jié)果

干預(yù)72 h后，AngⅡ組α-SMA表達(dá)增加，而AngⅡ+Ang-(1-7)組與AngⅡ組比較α-SMA表達(dá)下降(P＜0.05)，Ang-(1-7)組與正常對(duì)照組僅有少量α-SMA表達(dá)。Mas siRNA轉(zhuǎn)染組較AngⅡ+Ang-(1-7)組和陰性 siRNA對(duì)照組 α-SMA表達(dá)增加(P＜0.05)，見(jiàn)圖 3。

Figure 3．Expression ofα-SMA in NRK-49F cells measured by immunocytochemistry(×400)．1:normal control;2:AngⅡ;3:Ang-(1-7);4:AngⅡ +Ang-(1-7);5:Ang II+Ang-(1-7)+negative siRNA;6:Ang II+Ang-(1-7)+Mas siRNA．Mean ± SD．n=3．*P ＜0.05 vs 1;△P ＜0.05 vs4 or 5．圖3 免疫組化法測(cè)各組細(xì)胞α-SMA的表達(dá)

4 ELISA結(jié)果

干預(yù)72 h后，上清液中ColⅠ水平在AngⅡ組增加，而AngⅡ+Ang-(1-7)組與AngⅡ組比較ColⅠ水平下降(P＜0.05)，siRNA轉(zhuǎn)染組ColⅠ含量較AngⅡ+Ang-(1-7)組和陰性siRNA對(duì)照組增加(P＜0.05)，見(jiàn)圖4。

Figure 4．The content of ColⅠ in the culture supernatant．1:normal control;2:AngⅡ;3:Ang-(1-7);4:AngⅡ +Ang-(1-7);5:Ang II+Ang-(1-7)+negative siRNA;6:Ang II+Ang-(1-7)+Mas siRNA．Mean ±SD．n=6．*P ＜0.05 vs1;△P ＜0.05 vs 4 or 5．圖4 細(xì)胞上清液中ColⅠ的含量

討 論

腎臟纖維化是各種慢性腎臟疾病進(jìn)展致腎衰竭的主要病理改變和共同通路，而腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞被激活轉(zhuǎn)化成肌成纖維細(xì)胞，過(guò)多的分泌Ⅰ、Ⅲ型膠原及纖連蛋白，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)生成增多并沉積于腎間質(zhì)是腎間質(zhì)纖維化的主要特征之一［6-7］。

AngⅡ是一種主要作用于AT1受體的促生長(zhǎng)及促纖維化因子。而Ang-(1-7)是RAS中能夠拮抗AngⅡ作用的生物活性肽［8-10］。我們前期實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外培養(yǎng)大鼠腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞，已經(jīng)證實(shí)Ang-(1-7)可通過(guò)下調(diào)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor beta 1，TGF-β1)、胰島素樣生長(zhǎng)因子 I(insulinlike growth factor I，IGF-I)的表達(dá)，抑制 AngⅡ引起的腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞活化，使α-SMA表達(dá)下降，細(xì)胞外基質(zhì)成分ColⅠ的合成減少［3］。但是對(duì)于Ang-(1-7)是否通過(guò)與Mas受體結(jié)合發(fā)揮拮抗AngⅡ的上述作用尚待進(jìn)一步研究。故本實(shí)驗(yàn)采用RNA干擾技術(shù)，靶向抑制Mas基因表達(dá)后，觀察Ang-(1-7)拮抗AngⅡ作用的改變。

RNA干擾技術(shù)是利用長(zhǎng)度約為21個(gè)堿基的雙鏈RNA，根據(jù)堿基配對(duì)原則特異性地降解同源mRNA，抑制相應(yīng)基因的表達(dá)，是一種沉默靶基因的新興實(shí)驗(yàn)方法［11-12］。RNA干擾技術(shù)具有快速性，高效性，特異性等優(yōu)點(diǎn)，目前主要應(yīng)用于基因功能的研究、臨床診斷及基因治療［13］。因此，實(shí)驗(yàn)中我們針對(duì)Mas基因序列設(shè)計(jì)合成3對(duì)不同位點(diǎn)的siRNA，采用相對(duì)細(xì)胞毒性小且轉(zhuǎn)染效率高的轉(zhuǎn)染試劑HiPerFect Transfection Reagent進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，發(fā)現(xiàn)Mas siRNA序列2對(duì)Mas的抑制率達(dá)52%。由此可見(jiàn)，該組序列的Mas siRNA能有效抑制Mas表達(dá)。

在腎素-血管緊張素系統(tǒng)中，Mas受體是由Mas原癌基因編碼的，含有7個(gè)疏水跨膜結(jié)構(gòu)域的G蛋白偶聯(lián)的受體。已發(fā)現(xiàn)Mas受體在腎臟、心臟、下丘腦、胰腺和睪丸等器官中均有表達(dá)。目前，已有大量研究表明Ang-(1-7)通過(guò)與Mas受體結(jié)合產(chǎn)生作用，Botelho等［14］分別給Mas基因敲除的小鼠及正常小鼠輸注Ang-(1-7)后，發(fā)現(xiàn)與正常小鼠相比，Mas基因缺失小鼠心搏量，腎、肺、脾臟血流量均明顯減少，說(shuō)明Ang-(1-7)可通過(guò)與Mas受體結(jié)合調(diào)節(jié)全身及局部的血流量。Sampaio等［15］也證實(shí) Ang-(1-7)通過(guò)作用于Mas受體激活內(nèi)皮型一氧化氮合酶，調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮功能。另外，在大鼠心臟實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)Ang-(1-7)通過(guò)激活Mas受體呈劑量依賴性地抑制AngⅡ介導(dǎo)的ERK1/2磷酸化，從而改善心功能［16］。同樣，動(dòng)物離體實(shí)驗(yàn)中亦發(fā)現(xiàn)，在Mas基因缺失的小鼠，Ang-(1-7)對(duì)其主動(dòng)脈的血管舒張作用消失［17］。然而，有研究發(fā)現(xiàn)Ang-(1-7)亦可作用于AT1、AT2等非 Mas受體，De Souza等［18］證實(shí) Ang-(1-7)呈劑量依賴性抑制大鼠近端小管Na+/K+-ATP酶活性，AT2受體拮抗劑可消除此作用，故認(rèn)為Ang-(1-7)通過(guò)與AT2受體結(jié)合而發(fā)揮水鈉調(diào)節(jié)的作用。我們采用siRNA靶向抑制Mas基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)Mas表達(dá)下降后，Ang-(1-7)對(duì)AngⅡ的拮抗作用明顯下降，細(xì)胞α-SMA的表達(dá)和上清液中ColⅠ的分泌明顯升高，與Su等［4］研究結(jié)果相似。因此，我們認(rèn)為Ang-(1-7)主要通過(guò)與Mas受體結(jié)合，發(fā)揮其拮抗AngⅡ?qū)δI間質(zhì)成纖維細(xì)胞的激活作用。

綜上所述，Mas受體在Ang-(1-7)拮抗AngⅡ、減緩腎間質(zhì)纖維化中占有重要的地位，同時(shí)也為臨床防治腎臟纖維化提供了一條新的途徑。