李升紅， 萬 婷， 劉宏偉△， 程 飚， 肖麗玲， 謝光輝， 盧金強， 肖 靜

(1暨南大學附屬第一醫(yī)院整形外科，再生醫(yī)學教育部重點實驗室，廣東廣州510632;2廣州市婦女兒童醫(yī)療中心婦產科，廣東廣州510623;3廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院整形外科，廣東廣州510110)

血管緊張素Ⅱ(angiotensin II，Ang II)是腎素血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)最重要的活性產物，在應激情況下調控血壓和水電解質平衡，而且在創(chuàng)傷修復中發(fā)揮重要作用［1-4］。Ang II 1型受體(angiotensin II type 1 receptor，AT1受體)介導了Ang II的大部分病理生理作用，大量的研究資料證實AngII與其AT1受體結合后具有促進創(chuàng)面內細胞增殖、分化、遷移及促進創(chuàng)面內細胞因子表達的作用［5-8］。近來有研究證實AT1受體阻斷劑具有抑制創(chuàng)面內上皮化、肉芽組織形成和抑制創(chuàng)面內局部生長因子的產生，延緩創(chuàng)面愈合的作用［9-10］。

然而Ang II及其2型受體(AT2受體)在創(chuàng)面如何發(fā)揮作用尚不清楚。為進一步闡明AT2受體在Ang II調控創(chuàng)面修復中的作用及其機制，我們通過建立小鼠背部全層皮膚缺損創(chuàng)面模型，觀察阻斷AT2受體后對創(chuàng)面愈合過程及其對創(chuàng)面局部生長因子表達的影響，探討AngⅡ和AT2受體調控皮膚損傷修復的作用及其可能的機制。

材料和方法

1 材料

小鼠表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)定量酶聯檢測試劑盒購自RB。HE染色試劑購自廣州化學試劑公司。

2 動物分組及方法

2.1 小鼠創(chuàng)面模型的建立 健康SPF級近交系雄性C57BL/6J小鼠42只，8～10周齡，體重25～30 g，由南方醫(yī)科大學動物實驗中心提供(許可證號為SCXK粵2006-0015)。采用隨機數字表法根據檢測需要隨機分成對照組和PD123319處理組，每個時點3只小鼠，每實驗組21只小鼠。在小鼠背部距離中線5 mm兩側各制作1個直徑為6 mm的圓形全層皮膚缺損創(chuàng)面。創(chuàng)面形成后，對照組小鼠每天腹腔注射生理鹽水0.1 mL，PD123319處理組小鼠每天腹腔注射濃度為1.25 g/L的PD123319溶液0.1 mL(1.25 mg PD123319溶于1 mL生理鹽水，每天10 mg/kg)［11-13］。創(chuàng)面形成后第 3、5、7、9、11、13、15 天切取包括2 mm正常組織的創(chuàng)面組織標本，每個標本均分為2份，分別用液氮保存及10%中性甲醛固定。

2.2 創(chuàng)面愈合率的計算 小鼠處死前，以0.08 mL 10%水合氯醛麻醉小鼠，創(chuàng)面附近加標準比例尺，在距離創(chuàng)面10 cm的上方用數碼相機(Sony，1 010萬像素)拍照。以ImageJ圖像分析軟件結合標準比例尺分別計算出各實驗組小鼠各時點創(chuàng)面面積占原始面積大小，作為各時點創(chuàng)面愈合的百分率。計算公式如下:創(chuàng)面愈合率(%)=(1-各時點創(chuàng)面面積/原始創(chuàng)面面積)×100%。

2.3 創(chuàng)面愈合過程中上皮爬行距離的計算 10%甲醛固定標本，石蠟包埋切片，HE染色，染色切片在Leica核型分析顯微鏡5 010倍下觀察創(chuàng)面愈合過程中上皮爬行距離并拍照，按比例尺計算創(chuàng)面上皮爬行距離(mm)。

2.4 創(chuàng)面內肉芽組織面積計算 10%甲醛固定標本，石蠟包埋切片，HE染色，顯微鏡下觀察肉芽組織形成情況，連續(xù)采集50倍照片并拼圖。以ImageJ圖像分析軟件結合標準尺分別計算出各實驗組小鼠各時點肉芽組織的面積(mm2)。

2.5 創(chuàng)面EGF、VEGF和bFGF含量的測定 采用雙抗體夾心ABC-ELISA法，將保存在液氮中的新鮮組織標本各取0.2 g，電動勻漿機研磨，4℃、15 000 r/min離心30 min(離心半徑為6 cm)，取上清與PBS液溶解測定EGF、VEGF和bFGF的蛋白濃度。用抗鼠EGF、VEGF和bFGF單抗包被于酶標板上，標準品和樣品中的鼠EGF、VEGF和bFGF與單抗結合，加入生物素化的抗鼠EGF、VEGF和bFGF抗體，形成免疫復合物連接在板上，辣根過氧化物酶標記的Streptavidin與生物素結合，加入酶底物OPD，出現黃色，加入硫酸終止液，在450 nm處測吸光度(A)值，每個樣本重復3次，小鼠EGF、VEGF和bFGF濃度與A值呈正比，通過繪制標準曲線求出各時點小鼠創(chuàng)面標本中EGF、VEGF和bFGF的濃度，將上述求出的濃度計算時乘以總稀釋倍數(樣本稀釋倍數)，再除以0.2 g/1.5 mL(樣品量與生長因子提取液之比)。

3 統(tǒng)計學處理

數據以均數±標準差(mean±SD)表示，應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析，組間數據用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 PD123319對創(chuàng)面愈合率的影響

對照組小鼠背部直徑6 mm全層皮膚缺損創(chuàng)面在傷后第3天面積縮小至(30.62±4.96)%，在傷后第5天愈合率明顯加快，愈合率約為(63.55±2.57)%，第7天愈合率為(80.78±4.65)%，第9天愈合率為(93.19±6.72)%。PD123319處理組小鼠創(chuàng)面在傷后第3天面積縮小至(32.88±5.17)%，在傷后第5天、第7天與對照組差別較大，愈合率分別為(79.89±4.56)%和(88.98±3.83)%，第9天的愈合率為 (95.68±3.65)%，見圖1。

Figure 1.Effect of PD123319 on the rates of wound healing.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs control group.圖1 PD123319對創(chuàng)面愈合率的影響

2 PD123319對創(chuàng)面愈合過程中上皮爬行距離的影響

上皮化是創(chuàng)面愈合的重要標志。在創(chuàng)面形成后第3天出現明顯的上皮爬行現象。在傷后第3天對照組上皮爬行距離為(0.25±0.08)mm，PD123319處理組上皮爬行距離為(0.27±0.11)mm，在傷后第5天對照組的上皮爬行距離為(1.22±0.15)mm，PD123319處理組在創(chuàng)面形成第5天上皮爬行距離為(1.65±0.12)mm。在傷后第7天對照組上皮爬行距離為(1.93±0.17)mm，PD123319處理組上皮爬行距離為(2.36±0.18)mm，見圖2。

3 PD123319對創(chuàng)面內肉芽組織形成的影響

創(chuàng)面內肉芽組織是由新生的成纖維細胞和毛細血管組成，對創(chuàng)面愈合起著重要的作用。小鼠背部6 mm圓形創(chuàng)面在第3天后形成肉芽組織，對照組第3天肉芽組織面積為(11.96±1.12)mm2，第5天面積為(9.37±0.53)mm2，第7天面積為(7.15±0.42)mm2;PD123319處理組第3天面積為(12.17±1.73)mm2，第5天面積為(11.51±0.98)mm2，第 7天面積為(9.32±0.67)mm2，PD123319處理組小鼠肉芽組織面積明顯低于對照組小鼠，見圖3。

4 PD123319對創(chuàng)面愈合過程中 EGF、VEGF和bFGF產生的影響

因PD123319對創(chuàng)面愈合過程中創(chuàng)面愈合率、肉芽組織形成和上皮爬行距離的影響在傷后第5和7天表現出最為明顯的效應，因而于創(chuàng)面形成后第5和7天檢測創(chuàng)面新鮮肉芽組織中EGF、VEGF和bFGF表達量的變化，結果發(fā)現PD123319組小鼠創(chuàng)面肉芽組織中的生長因子表達量明顯高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見圖4。

Figure 2.Effect of PD123319 on migration distance of the epithelium(HE staining，×50).Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs control group.圖2 PD123319對創(chuàng)面愈合過程中上皮化的影響

Figure 3.Effect of PD123319 on granulation tissue area(HE staining，×50).Mean±SD.n=6.*P ＜0.05 vs control group.圖3 PD123319對創(chuàng)面內肉芽組織形成的影響

討 論

AngⅡ是RAS最重要的生物活性肽，除經典作用外還作為一個多效應生長因子可影響細胞的增殖、凋亡和分化，參與皮膚組織的胚胎發(fā)育、自我更新和損傷修復［3］。目前已經明確的血管緊張素受體主要是AT1和AT2受體［14］。血管緊張素受體阻滯劑是新一類抗高血壓藥物，其作用機制為競爭性拮抗AT1或AT2受體，能夠完全阻斷Ang II通過AT1或AT2發(fā)揮其生理作用。目前普遍認為AngⅡ主要的病理生理學作用由AT1受體介導［6］，其與 AngⅡ結合在外周組織可以刺激生長因子合成，促進細胞增生、遷移及促進創(chuàng)面細胞因子的表達，誘導血管生成。AT2受體的作用可能與AT1受體相反，在機體內環(huán)境中，AT2受體激活后可發(fā)揮抑制增殖、舒張血管、促進凋亡等作用［15］。Munk 等［16］發(fā)現在小鼠缺血心肌模型中AngⅡ通過AT2受體可以誘導血管形成。Waseda等［17］在小鼠肺纖維化動物模型中發(fā)現AngⅡ與AT2受體結合可以減輕博來霉素導致的纖維化。Izu等［18］發(fā)現 AT2阻滯劑能夠促進骨質形成。吳姮君等［4］發(fā)現在小鼠皮膚組織中有AT2受體的表達，AT2受體在創(chuàng)面形成后逐漸升高，在創(chuàng)面愈合后即開始下降，當創(chuàng)面愈合后再次逐漸升高，AT2受體可能與創(chuàng)面內細胞凋亡及其創(chuàng)面愈合后的重建塑型有關。

然而AT2受體在皮膚創(chuàng)傷愈合過程中的作用卻知之甚少。為探明AngⅡ及其AT2受體在創(chuàng)面愈合過程中的作用，我們通過給予AT2受體特異性阻斷劑PD123319，觀察其對創(chuàng)面愈合的影響。在本實驗中我們觀察到PD123319加快了小鼠創(chuàng)面愈合的速度，創(chuàng)面內上皮爬行和肉芽組織形成都表現出明顯加快的現象。因此推測AT2受體阻滯劑能夠促進創(chuàng)面內上皮細胞遷移和肉芽組織形成，具有促進創(chuàng)傷愈合的作用。

此外，使用AT2受體特異性阻斷劑后，在創(chuàng)面形成后第5天和第7天創(chuàng)面組織內EGF、VEGF和bFGF的含量明顯高于對照組小鼠。因此推測AT2受體阻斷劑促進創(chuàng)面上皮化和肉芽組織形成可能與促進創(chuàng)面局部生長因子的表達有關。

綜上所述，阻滯AT2受體可以促進創(chuàng)面上皮細胞遷移和肉芽組織形成，其促進創(chuàng)面愈合的作用可能與其促進創(chuàng)面內EGF、VEGF和bFGF等生長因子的表達有關。本研究結果將有可能為難愈創(chuàng)面和瘢痕的治療提供新的思路和方法。