馬小娟， 馬 琪， 于文燕△， 孫 湛， 劉熠雯， 王燕杰， 郭 文， 王 珍

(新疆醫(yī)科大學1病理生理學教研室，2機能中心，3臨床醫(yī)學系，新疆 烏魯木齊830011)

急性腎功能衰竭(acute renal failure，ARF)是一種常見的臨床危重癥，盡管醫(yī)療水平有了較大的提高，死亡率仍然居高不下。目前認為，腎小球濾過率(glomerular filtration rate，GFR)的急劇降低是 ARF發(fā)病的關鍵環(huán)節(jié)。目前臨床多采用對癥治療。尿毒清是一純中藥制劑，主要由大黃、黃芪、丹參、川芍、黨參、車前草、甘草等物質組成，具有降低血肌酐、尿素氮及減少尿蛋白等功效，因此可在一定程度上穩(wěn)定腎臟功能，延緩透析時間。但部分病人服用后易產生嚴重的腹瀉，從而使機體發(fā)生水電解質代謝紊亂，加重病情。既往的研究發(fā)現(xiàn)，黑木耳可通過抗氧化作用減輕大鼠慢性腦缺血損傷［1］，本課題組的研究也表明，在感染性休克和膿毒血癥時，黑木耳可通過降低血清中內毒素、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factorα，TNF-α)及白細胞介素 1(interleukin 1，IL-1)的含量，而對重要臟器發(fā)揮保護作用［2］。黑木耳在ARF的發(fā)病過程中是否也具有保護作用，目前尚無相關報道。本實驗通過觀察黑木耳粗提物在大鼠腹腔注射順鉑誘發(fā)急性腎功能衰竭中的作用，探討其可能的機制。

材料和方法

1 材料

1．1 動物 選取清潔級健康Wistar雄性大鼠32只(由新疆醫(yī)科大學動物實驗中心提供)，體重200～250 g。

1．2 主要試劑及儀器 尿毒清顆粒(內蒙古康臣藥業(yè)有限責任公司)，順鉑(江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司)，東北黑木耳(產地山東煙臺)，Cobasb121血氣和電解質分析儀、尿素氮和肌酐測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所，逆轉錄試劑盒(Invitrogen)，實驗用引物由生工上海生物工程股份有限公司設計并合成。

2 動物及分組

32只Wistar大鼠隨機分為:(1)對照組:1次腹腔注射(ip)與順鉑等容積生理鹽水(NS);(2)模型組:1次ip順鉑6 mg/kg;(3)黑木耳組:1次ip順鉑6 mg/kg+灌胃注入黑木耳粗提液(15 mL/kg);(4)尿毒清組:1次ip順鉑6 mg/kg+灌胃注入尿毒清溶液(3 g·kg－1·d－1)。每組8 只。

3 方法

各組大鼠分別腹腔注射等容積的生理鹽水和順鉑，治療組分別經胃灌注黑木耳粗提物和尿毒清。1周后從頸動脈采血測定指標，處死動物。取右腎組織快速置于液氮中，左腎組織固定于10%甲醛中，常規(guī)石蠟包埋。

4 檢測指標

4．1 血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)和肌酐(creatine，Cr)的測定 從頸動脈采血2 mL后離心15 min(3 500 r/min)取上清，后按照試劑盒操作說明書測定BUN及Cr。

4．2 血氣分析 各組大鼠從頸動脈采血，采用Cobasb121儀器即刻測定血氣，包括血K+濃度、pH值、氧分壓(partial pressure of oxygen，PO2)、二氧化碳分壓(partial pressure of carbon dioxide，PCO2)、氧飽和度(oxygen saturation，SO2)、緩沖堿(buffer base，BB)和陰離子間隙(aninon gap，AG)。

4．3 RT-PCR檢測各組大鼠腎組織內皮素1(endothelin-1，ET-1)mRNA的表達水平 用Trizol法提取各組大鼠腎組織總RNA，后使用。試劑盒逆轉錄為cDNA，并進行PCR擴增，用1%瓊脂糖凝膠電泳，測定各組ET-1與β-actin的灰度值并進行半定量分析。ET-1上游引物5'-atacacaaccgagcacattgac-3'，下游引物5'-tcagacacgaacactccctaag-3'，PCR產物為401 bp，退火溫度為 55℃。β-actin上游引物5'-acccccactgaaaaagatga-3'，下 游 引 物 5'-atcttcaaacctccatgatg-3'，PCR產物為120 bp，退火溫度為57℃。

5 統(tǒng)計學處理

采用SPSS17．0統(tǒng)計軟件包對數據進行分析。數據以均數±標準差(mean±SD)表示，實驗數據經方差齊性檢驗后，采用方差分析和t檢驗，檢驗水準α=0.05。

結 果

1 BUN和Cr的變化

模型組、黑木耳組和尿毒清組與對照組比較，BUN和Cr含量差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，黑木耳組中BUN和Cr的含量均低于模型組(P＜0.05)，見表 1。

表1 各組大鼠BUN和Cr含量的變化Table 1．Changes of BUN and Cr in every group(Mean±SD．n=8)

2 各組大鼠腎組織ET-1 mRNA表達水平

模型組與尿毒清組中ET-1 mRNA的表達高于對照組和黑木耳組(P＜0.05)，而黑木耳組與對照組比較，ET-1 mRNA的表達無顯著差異(P＞0.05)，見圖1。

3 血氣分析

pH值:模型組、尿毒清組與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，而黑木耳組的pH值與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);PO2:模型組、黑木耳組和尿毒清組PO2高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);PCO2:模型組的PCO2高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，但黑木耳組與尿毒清組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);SO2:模型組、尿毒清組SO2低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，但黑木耳組與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，尿毒清組SO2低于黑木耳組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);BB:模型組、黑木耳組和尿毒清組均低于對照組(P＜0.05)，且黑木耳組高于模型組和尿毒清組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);AG:模型組、黑木耳組和尿毒清組高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，且尿毒清組高于黑木耳組(P＞0.05);血K+濃度:模型組和尿毒清組血K+濃度高于對照組和黑木耳組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見表 2。

Figure 1．The expression of ET-1 mRNA in renal tissues in different groups．Mean ± SD．n=8．▲ P ＜ 0.05 vs control group;☆P＜0.05 vs model group;△P＜0.05 vs black fungus group．圖1 各組腎組織中ET-1 mRNA的表達

表2 各組大鼠血氣指標的變化Table 2．Changes of the blood gas in every group(Mean±SD．n=8)

Figure 2．The pathological changes of renal tissues in different groups(HE staining，×400)．A:control group;B:model group;C:black fungus group;D:niaoduqing group．圖2 各組腎組織病理學改變

4 各組大鼠腎組織病理學改變

正常組腎小球毛細血管未見擴張、充血，腎小管未見擴張，間質無出血;模型組可見腎小球毛細血管呈中、重度擴張充血，部分腎小管間質出血;黑木耳組中僅見腎小管擴張及間質血管的擴張充血;尿毒清組中腎小球毛細血管中度擴張充血，部分腎小管擴張，腎小管上皮輕度水腫，見圖2。

討 論

ARF是指各種原因在短期內(通常數小時至數天)，引起腎臟泌尿功能急劇障礙，以致機體內環(huán)境出現(xiàn)嚴重紊亂的病理過程。而內環(huán)境的紊亂又可加重原有的病情［3］。腎臟除具有泌尿功能外，還具有內分泌功能，可合成與分泌ET-1。ET通過自分泌與旁分泌的方式調節(jié)腎臟的功能，被認為是進行性腎損傷的調節(jié)因子［4］。

本研究顯示，模型組腎組織ET-1 mRNA表達為0．89±0．06，且BUN和Cr的含量均明顯高于對照組(P＜0.05)，可能是由于順鉑導致了腎血管的收縮，使腎血流量及GFR降低所致［5］。而腎損傷時腎內血流重分布又將影響腎血流動力學，促使內皮細胞合成并分泌更多的ET-1，即通過正反饋調節(jié)加速了腎小球的損傷。

尿毒清是臨床上常用的腸道吸附劑，具有通腑降濁、健脾利濕、活血化瘀等功效，但對腎小球的作用不明顯［6］。本實驗通過使用尿毒清灌胃后發(fā)現(xiàn)，尿毒清組ET-1 mRNA的表達、BUN和Cr的含量均低于模型組，但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。而黑木耳隸屬于真菌門，其中含大量由多糖及蛋白質等物質組成的木耳凝膠，對人體有重要的生理功能?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)可提高機體免疫力、抗腫瘤、降血脂和抗炎等功能。本實驗黑木耳組中ET-1 mRNA的表達明顯減少，BUN和Cr的含量也低于模型組。故考慮黑木耳可能通過減少血管活性物質的釋放，調節(jié)局部血管的張力，從而改善腎血流量及腎小球的濾過功能，減少了代謝產物在體內的堆積。

AFR少尿期機體發(fā)生“一少四多”(少尿、水中毒、高鉀血癥、代謝性酸中毒和氮質血癥)，其中高鉀血癥是最危險的改變，而其與代謝性酸中毒又互為因果［3］。因此，本實驗觀察了各組血氣指標的改變后發(fā)現(xiàn)，模型組的pH值、PCO2和BB與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);尿毒清組的pH值、BB與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，但PCO2與對照組比較無顯著差異(P＞0.05)，提示模型組和尿毒清組均發(fā)生了失代償性的呼吸性堿中毒合并代謝性酸中毒。同時兩組血清K+濃度均明顯高于對照組(P＜0.05)。黑木耳組中pH值、PCO2與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，而BB低于對照組(P＜0.05)，提示黑木耳組發(fā)生了代償性的呼吸性堿中毒合并代謝性酸中毒，且血清K+濃度低于模型組和尿毒清組(P＜0.05)。故考慮黑木耳粗提物可能通過維持體內電解質和酸堿平衡以達到改善內環(huán)境的目的。

綜上所述，黑木耳在急性腎功能衰竭的發(fā)病過程中，具有一定的保護作用。其機制可能是影響了血管活性物質的合成與釋放，調節(jié)體內電解質和酸堿的平衡，最終維持內環(huán)境的穩(wěn)定。但是黑木耳對急性腎功能衰竭的腎小管有無作用，仍有待進一步研究。