陳 蕊， 劉培晶， 嚴(yán)金川△， 顧雨春

(1江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院心內(nèi)科，江蘇鎮(zhèn)江212001;2北京大學(xué)分子醫(yī)學(xué)研究所，北京100871)

肺動(dòng)脈高壓是一種以肺循環(huán)阻力和肺動(dòng)脈壓進(jìn)行性增加為特征的疾病，其發(fā)病率、致殘率和病死率都很高。K+通道在調(diào)節(jié)肺血管張力、肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(pulmonary artery smooth muscle cells，PASMCs)靜息膜電位、增殖凋亡及肺血管重構(gòu)時(shí)發(fā)揮重要作用。PASMCs上主要存在5類鉀離子通道，包括鈣激活性鉀離子通道(calcium-activated potassium channel，KCa)、電壓門控型鉀離子通道 (voltage-dependent potassium channel，KV)、內(nèi)向整流性鉀離子通道(inward rectifier potassium channel，KIR)、ATP 敏感性鉀離子通道(ATP-sensitive potassium channel，KATP)和雙孔鉀通道(two-pore-domain potassium channel，K2P)［1］。大電導(dǎo)鈣激活性鉀通道(large-conductance calcium-activated potassium channel，BKCa)是 KCa的一種亞型，廣泛分布于各類動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞上，對(duì)血管舒張起重要調(diào)節(jié)作用。

ω-3多不飽和脂肪酸(ω-3 polyunsaturated fatty acid，ω-3 PUFA)能通過減少缺氧性肺動(dòng)脈高壓模型中肺血管肌化、抑制肺纖維化等途徑實(shí)現(xiàn)抗肺動(dòng)脈高壓的作用［2］。ω-3 PUFA主要包括二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid，DHA)和二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid，EPA)。目前研究發(fā)現(xiàn)，DHA對(duì)心肌細(xì)胞及冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞上多類離子通道有作用，但其對(duì)PASMCs上離子通道的影響尚不明確。本研究采用膜片鉗技術(shù)觀察DHA對(duì)Sprague-Dawley大鼠PASMCs上BKCa的影響，探討DHA抗肺動(dòng)脈高壓的離子機(jī)制。

材料和方法

1 動(dòng)物和器材

清潔級(jí)Sprague-Dawley大鼠，體質(zhì)量(180±30)g，雌雄不拘，由江蘇大學(xué)動(dòng)物中心提供。Multiclamp 700B膜片鉗放大器(Axon)，DigiData 1322型數(shù)/模(或模/數(shù))轉(zhuǎn)換器(Axon)，pClamp 10．2 脈沖發(fā)放和數(shù)據(jù)采集軟件(Axon)。C1SI激光掃描共聚焦顯微鏡(Nikon)。

2 試劑及溶液

DHA(Sigma)使用前以無水乙醇配制成10 mmol/L的母液，分裝避光保存于－20℃?zhèn)溆?。使用時(shí)無水乙醇的終濃度＜0．4%，以防止無水乙醇對(duì)離子通道的影響。分離血管用生理鹽溶液(PSS)成份(mmol/L):NaCl 130，KCl 5，MgCl21．2，CaCl21．5，HEPES 10，葡萄糖10。分離細(xì)胞用無鈣PSS液，將分離血管用的PSS液中的CaCl2用等摩爾MgCl2代替。2種PSS液用NaOH調(diào)節(jié)pH至7．4。分離平滑肌細(xì)胞酶液(g/L):木瓜蛋白酶4，膠原酶Ⅰ型2，牛血清白蛋白1，二硫蘇糖醇0．5，溶于無鈣PSS液中。記錄BKCa電流的細(xì)胞外液 (mmol/L):NaCl 145，KCl 4．0，CaCl21．0，MgCl21．0，HEPES 10，葡萄糖 10，用NaOH調(diào)pH至7．4。記錄 BKCa電流的電極內(nèi)液(mmol/L):KCl 125，Na2ATP 5，Na2GTP 0.5，MgCl24，HEPES10，EGTA 0．1，用 KOH 調(diào)節(jié) pH 值至7．4。同時(shí)細(xì)胞外液加KV通道特異性抑制劑4-氨基吡啶(5 mmol/L)。急性缺氧溶液:2 mmol/L連二亞硫酸鈉細(xì)胞灌流液，此時(shí)氧分壓在60 min內(nèi)為0 mmHg，pH 值不發(fā)生改變［3］。

3 DHA對(duì)BK Ca電流的作用

大鼠單個(gè)PASMC的分離采用傳統(tǒng)的酶解方法［4］。取酶解獲得的細(xì)胞懸液于預(yù)處理有L-多聚賴氨酸的玻片中，將玻片粘于灌流槽，待細(xì)胞充分貼壁，平放在倒置顯微鏡上，取狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行膜片鉗實(shí)驗(yàn)。記錄電極用玻璃毛細(xì)管，經(jīng)電極拉制儀拉制成微電極，阻抗為3～6 MΩ。用全細(xì)胞膜片鉗記錄方法，在電壓鉗下記錄BKCa電流。記錄電流時(shí)，鉗制電壓為－70 mV，指令電壓從－60 mV至+60 mV，階躍電壓為10 mV，脈沖時(shí)間為400 ms的去極化刺激13次，頻率為0．2 Hz，信號(hào)采集頻率為10 kHz，濾波頻率為2 kHz。采樣后數(shù)據(jù)由Clampfit 10．2軟件自動(dòng)記錄，存儲(chǔ)于計(jì)算機(jī)硬盤內(nèi)，供測(cè)量分析。所有實(shí)驗(yàn)均在室溫(25±1)℃下進(jìn)行。通道電流密度(pA/pF)為電流強(qiáng)度與細(xì)胞膜電容的比值，以消除不同細(xì)胞表面積的電流誤差，膜電容可直接在放大器上讀出。觀察0、0．01、0．1、1 和10 μmol/L DHA對(duì)BKCa電流的影響。

4 急性缺氧及急性缺氧+DHA對(duì)BK Ca電流的作用

同樣方法記錄 BKCa電流，以含有終濃度為2 mmol/L連二亞硫酸鈉的細(xì)胞灌流液灌流，觀察急性缺氧對(duì)BKCa電流的影響。以含有10μmol/L DHA的急性缺氧溶液灌流，觀察急性缺氧時(shí)DHA對(duì)BKCa電流的作用。

5 DHA對(duì)PASMCs胞內(nèi)游離鈣離子濃度(［Ca2+］i)的影響

酶解法獲得 PASMCs后，加入含 Fluo-8/AM(5 μmol/L)的D-Hanks液，置37℃培養(yǎng)箱中避光孵育20 min，棄孵育液，D-Hanks液清洗3次，將載有細(xì)胞的玻片移入激光共聚焦顯微鏡載物臺(tái)的灌流槽，激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為530 nm。細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度(fluorescence intensity，F(xiàn)I)的變化可指示［Ca2+］i的相對(duì)變化。激光共聚焦顯微鏡下連續(xù)動(dòng)態(tài)掃描，每視野觀察3～4個(gè)細(xì)胞，每秒取一幀圖像，共400 s，應(yīng)用連續(xù)激光掃描曲線觀察細(xì)胞內(nèi)［Ca2+］i的變化。

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。用SPSS 17．0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，自身對(duì)照采用配對(duì)t檢驗(yàn)或單因素方差分析，組間資料采用非配對(duì)t檢驗(yàn)，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。數(shù)據(jù)處理使用OriginPro 7．5科技繪圖及數(shù)據(jù)分析軟件。

結(jié) 果

1 DHA對(duì)大鼠PASMCs BK Ca的影響

DHA濃度為0．01μmol/L時(shí)，BKCa的電流強(qiáng)度有所增加，但與對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;0.1、1和10μmol/L DHA對(duì)BKCa電流強(qiáng)度呈濃度依賴性增加(圖 1A)，I-V曲線上移(圖 1B)(P＜0.01)，且該激活電流能被BKCa特異性抑制劑伊比利亞蝎毒素(iberiotoxin，IBTX)所抑制(圖1C)。在指令電壓為+60 mV時(shí)，不同濃度的 DHA(0．1、1和10μmol/L)使 BKCa電流密度分別增加(47．4±6.9)%、(323．0 ±13.1)%和(460．2 ±45．6)%。

2 急性缺氧及DHA對(duì)BK Ca的作用

急性缺氧能抑制 BKCa(圖2A)，I-V曲線下移(圖2B)。指令電壓為+60 mV時(shí)，BKCa電流密度從(32．7 ±8．5)pA/pF 降低至(11．9 ±5．8)pA/pF(P＜0．01)。DHA(10μmol/L)能逆轉(zhuǎn)急性缺氧對(duì)BKCa的抑制作用(P ＜0．01)，見圖3。

3 DHA 對(duì) PASMCs［Ca2+］i的影響

未灌流DHA前，細(xì)胞熒光強(qiáng)度均勻;灌流DHA 50 s后，即刻發(fā)生熒光面積縮小，強(qiáng)度增加，在150 s達(dá)峰值，［Ca2+］i最大增加率為(71．9 ±4．1)%(P ＜0．01)，之后逐漸降低，見圖 4。

Figure 1．DHA increased whole-cell BKCa currents in rat PASMCs．A:representative tracings showed BKCa currents at different DHA concentrations(0，0．01，0．1，1 and 10 μmol/L)．B:I-V relationships of BKCa currents at different DHA concentrations．Mean± SD．n=5．＊＊P ＜ 0．01 vs control．C:representative tracings showed that the DHA-activated K+currents were inhibited by iberiotoxin(IBTX)．圖1 不同濃度DHA對(duì)大鼠PASMCs BK Ca電流的影響

討 論

肺動(dòng)脈高壓的發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，目前尚未完全清楚，其病因包括肺血管床減少及低氧導(dǎo)致的肺血管收縮。低氧造成的PASMCs鉀離子流減少，鉀通道活性降低及其基因表達(dá)減少在肺動(dòng)脈高壓的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用［5］。BKCa分布廣泛，其開放具有Ca2+敏感性和電壓依賴性。持續(xù)激活BKCa會(huì)引起膜超極化，降低L型鈣通道活性，發(fā)揮負(fù)反饋?zhàn)饔?，引起血管平滑肌舒?反之，抑制BKCa會(huì)導(dǎo)致血管收縮［6］。

DHA對(duì)心血管的保護(hù)作用已廣為人知。DHA能抑制心肌細(xì)胞膜上短時(shí)外向鉀電流(Ito)和延遲整流鉀電流(IK)，達(dá)到抗心律失常作用［7］。DHA經(jīng)過細(xì)胞色素P450表氧化酶代謝產(chǎn)生的環(huán)氧二十碳烯酸，可激活BKCa，使冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞處于超極化狀態(tài)，從而舒張冠狀動(dòng)脈［8］。因此，DHA通過影響離子通道而產(chǎn)生的心血管保護(hù)作用亦已被人們熟知。本研究顯示，DHA對(duì)離體 PASMCs細(xì)胞膜上BKCa有明顯激活作用;急性缺氧能明顯抑制BKCa，但這種抑制作用被DHA逆轉(zhuǎn)。研究發(fā)現(xiàn)慢性低氧性肺動(dòng)脈高壓大鼠PASMCs上的BKCa電流較正常大鼠顯著降低［9］。Dospinescu 等［10］發(fā)現(xiàn)肺靜脈平滑肌細(xì)胞膜上BKCa的氧氣敏感性與其α亞基的應(yīng)激調(diào)控外顯子(stress-regulated exon，STREX)結(jié)構(gòu)相關(guān)。而PASMCs上BKCa的氧氣敏感性是否也與STREX相關(guān)則有待進(jìn)一步研究。Thuringer等［11］發(fā)現(xiàn)低氧對(duì)兔肺動(dòng)脈主干PASMCs的BKCa無效應(yīng)。急性缺氧時(shí)，肺動(dòng)脈主干與體循環(huán)動(dòng)脈相似，主要發(fā)生舒張反應(yīng)，而阻力性肺動(dòng)脈主要發(fā)生快速可逆的收縮反應(yīng)［12］。因此我們認(rèn)為不同實(shí)驗(yàn)組結(jié)果有差異可能與研究的肺動(dòng)脈段標(biāo)本不同有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)在D-Hanks液中，DHA 可增加 PASMCs［Ca2+］i，這一效應(yīng)即刻發(fā)生，在達(dá)到峰值后，［Ca2+］i逐漸降低。［Ca2+］i增加主要通過細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流和細(xì)胞內(nèi)基質(zhì)網(wǎng)釋放，后者又被稱為鈣閃爍［13］。鈣閃爍現(xiàn)象可激活BKCa，引起平滑肌細(xì)胞的舒張［14］。研究發(fā)現(xiàn)，DHA可通過促進(jìn)三磷酸肌醇產(chǎn)生，激活蛋白激酶C，使U937細(xì)胞系發(fā)生外鈣內(nèi)流和內(nèi)鈣釋放，增加細(xì)胞內(nèi)［Ca2+］i，進(jìn)而誘導(dǎo)其凋亡［15］。DHA 亦可以通過這 2條途徑增加T細(xì)胞內(nèi)［Ca2+］i通道［16］。因此我們認(rèn)為DHA誘導(dǎo)PASMCs的內(nèi)鈣釋放，激活BKCa，K+外流增加導(dǎo)致細(xì)胞膜電位超極化，電壓依賴性鈣離子通道關(guān)閉，細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子減少，引起血管舒張，從而抵抗低氧誘發(fā)的肺血管收縮，發(fā)揮其抗肺動(dòng)脈高壓作用。

Figure 2．Inhibition of BKCa currents by hypoxia in rat PASMCs．A:representative tracings showed BKCa currents elicited by step depolarization(－60 to+60 mV in 10 mV increments)from a holding potential of－70 mV under normoxia and hypoxia．B:I-V relationships of BKCa currents under normoxia and hypoxia．Mean ±SD．n=5．＊＊P ＜0．01 vs normoxia．圖2 急性缺氧對(duì)BK Ca電流的影響

Figure 3．DHA increased whole-cell BKCa currents in rat PASMCs in hypoxia．A:representative tracings of BKCa currents under normoxia and hypoxia after preincubation with 10 μmol/L DHA．B:I-V relationships of BKCa currents under normoxia and hypoxia after pre-incubation with 10 μmol/L DHA．Mean±SD．n=5．＊＊P ＜0．01 vs normoxia．圖3 DHA預(yù)處理后，急性缺氧對(duì)BK Ca電流的影響

Figure 4．DHA increased［Ca2+］i in rat PASMCs．Mean±SD．n=17．＊＊P ＜0．01 vs control at 150 s．圖4 DHA對(duì)大鼠PASMCs［Ca2+］i的影響

肺動(dòng)脈高壓可致肺血管重構(gòu)，PASMCs增殖增加，凋亡減少，增殖和凋亡之間平衡失調(diào)，中膜肥厚。鉀通道的功能和表達(dá)與PASMCs增殖和凋亡密切相關(guān)。各種原因誘導(dǎo)的凋亡均存在較強(qiáng)的K+外流，使胞漿內(nèi)K+濃度降低。DHA是否通過調(diào)節(jié)PASMCs上鉀離子通道而抑制PASMCs的過度增殖尚需進(jìn)一步研究。