施 靜， 崔晶晶， 陽(yáng)海平△， 劉 瑋， 萬(wàn)俊麗， 王志鐵， 邱桂霞， 李 秋△

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院 1腎臟免疫科，2兒科研究所免疫室，重慶400014)

高脂血癥是兒童原發(fā)性腎病綜合征(primary ne- phrotic syndrome，PNS)重要的病理生理改變之一，脂質(zhì)代謝紊亂或持續(xù)的高脂血癥是腎臟損害的獨(dú)立危險(xiǎn)因素［1］，可致腎小球硬化。本課題組前期研究結(jié)果證實(shí)炎癥可加重脂質(zhì)介導(dǎo)腎臟損害，在腎小球硬化過(guò)程中起重要作用［2］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞加工蛋白質(zhì)和貯存Ca2+的主要場(chǎng)所，對(duì)各種理化因素如葡萄糖及氨基酸缺乏、缺血/缺氧、衣霉素等極為敏感，可引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工、運(yùn)輸障礙及攝取、釋放Ca2+障礙而致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)。持續(xù)或過(guò)強(qiáng)的ERS可致細(xì)胞凋亡［3］及炎癥反應(yīng)［4］。研究表明高糖、高半胱氨酸等可誘導(dǎo)人腎小球系膜細(xì)胞(human mesangial cells，HMCs)發(fā)生ERS，從而促進(jìn)其增殖、系膜外基質(zhì)產(chǎn)生增多;但目前高脂是否可通過(guò)啟動(dòng)ERS致HMCs損害尚不清楚。本研究旨在探討炎癥能否加重高脂負(fù)荷下HMCs ERS及其具體的分子機(jī)制，為臨床防治腎臟損害提供新的分子靶點(diǎn)。

材料和方法

1 主要試劑

RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)于 Gibco，優(yōu)等胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購(gòu)于天津TBD，白細(xì)胞介素1β(interleukin-1 beta，IL-1β)、兔抗人核轉(zhuǎn)錄因子 κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)購(gòu)于SAB，人低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDL)本實(shí)驗(yàn)室自備，4-苯基丁酸(4-phenyl butyric acid，4-PBA)及油紅O(oil red O)購(gòu)于Sigma，ELISA試劑盒購(gòu)于Ray Biotech。

2 方法

2．1 細(xì)胞來(lái)源 HMCs由英國(guó)倫敦大學(xué)學(xué)院皇家自由醫(yī)學(xué)院(University College London Medical School，Royal Free Campus)阮雄中教授惠贈(zèng)。

2．2 細(xì)胞培養(yǎng) 使用含有10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng) HMCs。24 h換液1次，48 h可傳代。

2．3 實(shí)驗(yàn)分組 待HMCs生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，將細(xì)胞分為4組:(1)對(duì)照組:RPMI-1640+10%FBS;(2)高脂組(LDL):RPMI-1640+10%FBS+200 mg/L LDL;(3)IL-1β+高脂組(IL-1β+LDL):RPMI-1640+10%FBS+20μg/L IL-1β+200 mg/L LDL;(4)4-PBA干預(yù)組(4-PBA+IL-1β+LDL):RPMI-1640+10%FBS+5 mmol/L 4-PBA+20 μg/L IL-1β +200 mg/L LDL。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后進(jìn)行各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)分析。

2．4 油紅O染色觀察HMCs胞內(nèi)脂質(zhì)沉積情況HMCs以2×104cells/well的密度接種于24孔板內(nèi)，實(shí)驗(yàn)干預(yù)后棄培養(yǎng)基，PBS洗滌3次。4%多聚甲醛固定30 min，ddH2O沖洗 2次，1，2-丙二醇孵育 2 min。室溫下油紅O工作液染色30 min，ddH2O洗3次，蘇木素復(fù)染1～2 min，自來(lái)水沖洗5 min，風(fēng)干，中性樹(shù)膠封片。

2．5 免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose-regulated protein 78，GRP78)的表達(dá) HMCs以2×104cells/well的密度接種于24孔板內(nèi)，實(shí)驗(yàn)干預(yù)后棄上清，PBS洗3次，4%多聚甲醛固定，1%Triton X-100，3%H2O2滅活，抗原修復(fù)，血清封閉，GRP78Ⅰ抗4℃孵育過(guò)夜，Ⅱ抗孵育。二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)顯色，蘇木素復(fù)染，風(fēng)干，中性樹(shù)膠封片。

2．6 實(shí)時(shí)定量 PCR(real-time PCR)檢測(cè)GRP78、蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase，PERK)和 α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)mRNA 水平將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HMCs按5×105cells/well的密度接種于6孔板內(nèi)，每組設(shè)3復(fù)孔。經(jīng)實(shí)驗(yàn)干預(yù)后收集細(xì)胞，按說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總RNA，RNA的A260/A280比值均為1．7～2．2。各組取等量RNA為模版逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。取1μL cDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR，以β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)為內(nèi)參照。擴(kuò)增條件:95℃ 3 min，之后95℃ 10 s，61．4℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。完成后用Gene Expression Analysis for iCycler iQ Real-Time PCR Detection System 1．10軟件(Bio-Rad)計(jì)算各樣本目的基因的相對(duì)表達(dá)量。PCR引物由Invitrogen合成，序列見(jiàn)表1。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR引物序列Table 1．Primer sequences for real-time PCR

2．7 Western blotting檢測(cè)胞核 NF-κB p65 蛋白的表達(dá) 將細(xì)胞接種于T25培養(yǎng)瓶中，經(jīng)實(shí)驗(yàn)干預(yù)后收集細(xì)胞。按試劑盒說(shuō)明書(shū)提取胞漿和胞核蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量并標(biāo)化，每孔胞核蛋白上樣量為40μg，β-actin作為內(nèi)參照。樣品加變性緩沖液煮沸5～10 min。SDS-PAGE垂直凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，TBST洗膜10 min×3次，加入Ⅰ抗 NF-κB(1∶2 000)和 β-actin(1∶1 000)進(jìn)行雜交，4℃孵育過(guò)夜;TBST洗膜10 min×3次，Ⅱ抗(1∶5 000)雜交，室溫孵育1 h，TBST漂洗10 min×3次。ECL光化學(xué)法進(jìn)行顯影。

2．8 ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)上清白細(xì)胞介素6(interleukin-6，IL-6)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)的含量 操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，以吸光度(absorbance，A)值表示上清中待測(cè)蛋白含量。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間差異采用單因素方差分析，采用SPSS 18．0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 油紅O染色檢測(cè)HMCs脂質(zhì)沉積

油紅O染色及半定量分析結(jié)果顯示，正常組HMCs中僅可見(jiàn)少量紅染顆粒，LDL組及 IL-1β+LDL組與其相比，紅染顆粒明顯增多(P＜0.05)，其中IL-1β+LDL組脂質(zhì)沉積較LDL組顯著增加(P＜0.05);經(jīng)4-PBA干預(yù)后HMCs胞內(nèi)脂質(zhì)沉積較IL-1β+LDL組顯著減少(P＜0.05)，見(jiàn)圖1。

Figure 1．Lipid accumulation in HMCs of different groups(oil red O staining，×400)．A:control group;B:LDL(200 mg/L)group;C:IL-1β (20 μg/L)+LDL(200 mg/L)group;D:4-PBA(5 mmol/L)+IL-1β (20μg/L)+LDL(200 mg/L)group．Mean±SD．n=3．*P ＜0．05 vs A;#P ＜0．05 vs C．圖1 各組HMCs油紅O染色結(jié)果

2 不同干預(yù)對(duì)HMCs ERS信號(hào)通路GRP78-PERK軸的影響

如圖2、3所示，正常組GRP78 mRNA及蛋白、PERK mRNA表達(dá)均處于較低的水平，予以LDL及IL-1β+LDL刺激后，可顯著增加其表達(dá)(均 P＜0.05)，其中 IL-1β+LDL組GRP78 mRNA及蛋白、PERK mRNA水平顯著高于LDL組(均P＜0.05);經(jīng)4-PBA干預(yù)后，其表達(dá)較IL-1β+LDL組顯著降低(均 P＜0.05)。

Figure 2．Expression of GRP78 and PERK mRNA in HMCs of different groups．Mean± SD．n=3．*P ＜0.05 vs control group;#P ＜0.05 vs IL-1β +LDL group．圖2 各組HMCs GRP78與PERK mRNA的表達(dá)

Figure 3．Immunocytochemistry results of GRP78 protein expression in HMCs of different groups(DAB staining，×400)．A:control group;B:LDL(200 mg/L)group;C:IL-1β (20 μg/L)+LDL(200 mg/L)group;D:4-PBA(5 mmol/L)+IL-1β (20μg/L)+LDL(200 mg/L)group．Mean± SD．n=3．*P＜0.05 vs A;#P＜0.05 vs C．圖3 各組HMCs GRP78蛋白的表達(dá)

3 Real-time PCR檢測(cè)不同干預(yù)對(duì)HMCsα-SMA mRNA水平的影響

如圖4所示，正常組存在低水平α-SMA mRNA表達(dá)，LDL刺激可增加其表達(dá)，IL-1β+LDL刺激后其表達(dá)水平顯著高于正常組及LDL組(均P＜0.05);4-PBA干預(yù)可顯著抑制 IL-1β+LDL誘導(dǎo) α-SMA mRNA表達(dá)(P＜0.05)。

Figure 4．Expression ofα-SMA mRNA in HMCs of different groups determined by real-time PCR．Mean±SD．n=3．*P ＜0.05 vs control group;#P ＜0.05 vs IL-1β +LDL group．圖4 各組HMCsα-SMA mRNA的表達(dá)

4 不同干預(yù)對(duì)HMCs核蛋白NF-κB p65及分泌IL-6、TGF-β1水平的影響

如圖5及表2所示，正常組NF-κB p65蛋白表達(dá)量、IL-6分泌量處于較低水平，予以LDL及IL-1β+LDL刺激后，NF-κB p65蛋白及IL-6水平均較正常組顯著上調(diào)(均P＜0.05)，其中 IL-1β+LDL組較LDL組明顯增多(均P＜0.05)，予以4-PBA干預(yù)可以明顯抑制 NF-κB p65及 IL-6的表達(dá)(均 P＜0.05);而各組HMCs分泌TGF-β1差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＞0.05)。

Figure 5．Expression of NF-κB p65 protein in HMCs of different groups determined by Western blotting．Mean ± SD．n=3．*P＜0.05 vs control group;#P ＜0.05 vs IL-1β+LDL group．圖5 各組HMCs NF-κB p65蛋白的表達(dá)

表2 各組細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-6和TGF-β1含量的比較Table 2．The levels of IL-6 and TGF-β1 in HMCs culture supernatants detected by ELISA(ng/L．Mean±SD．n=3)

5 HMCs脂質(zhì)沉積與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因及炎癥狀態(tài)的相關(guān)性分析

HMCs胞內(nèi)脂質(zhì)沉積與GRP78蛋白水平、PERK mRNA、NF-κB p65和 IL-6水平呈正相關(guān)(分別為:r=0.818，P ＜0.01;r=0.486，P ＜0.05;r=0.858，P＜0.01;r=0.582，P ＜0.05);GRP78 mRNA 與PERK mRNA、NF-κB p65 和 IL-6 水平呈正相關(guān)(分別為:r=0.660，P ＜0.01;r=0.784，P ＜0.01;r=0.825，P ＜0.01);NF-κB p65與 IL-6水平呈正相關(guān)(r=0.743，P＜0.01);而HMCs胞內(nèi)脂質(zhì)沉積和NF-κB p65水平與α-SMA mRNA水平無(wú)顯著相關(guān)性(分別為:r=0.021，P ＞0.05;r=0.137，P ＞0.05)。

討 論

1982年Moorhead等［1］首次提出“脂質(zhì)腎毒性”學(xué)說(shuō)以來(lái)，越來(lái)越多的研究表明脂質(zhì)代謝紊亂或持續(xù)高脂血癥是腎損害的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，可致慢性腎臟病或腎小球硬化。在局灶節(jié)段性腎小球硬化病人腎臟組織、高脂血癥動(dòng)物模型中，均能見(jiàn)到大量脂質(zhì)在腎臟沉積或泡沫細(xì)胞形成。本課題組既往研究已證實(shí)高脂可促進(jìn)HMCs分泌炎癥因子，加重炎癥反應(yīng)，最終致腎小球硬化［5］。但高脂致腎臟損傷或腎小球硬化的機(jī)制尚不清楚。

近來(lái)研究表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激－未折疊蛋白反應(yīng)(endoplasmic reticulum stress-unfolded protein response，ERS-UPR)在膜性腎病、膜增生性腎小球腎炎的發(fā)生發(fā)展中起重要作用［6-7］;且 ERS-UPR是脂質(zhì)代謝紊亂致動(dòng)脈粥樣硬化、炎癥發(fā)生、凋亡的關(guān)鍵信號(hào)通路［8］。目前對(duì)腎臟脂質(zhì)代謝紊亂與 ERS-UPR關(guān)系的研究較少。GRP78是ERS的主要分子伴侶及標(biāo)志蛋白，在調(diào)控ERS-UPR信號(hào)通路活化過(guò)程中發(fā)揮重要作用。在Ruan等［9］的研究中證實(shí)，炎癥因子IL-1β能明顯促進(jìn)HMCs脂質(zhì)的吸收，促進(jìn)胞內(nèi)膽固醇的合成，并減少其外流［10］，從而造成脂質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的異常積聚。本研究顯示，HMCs予以LDL刺激，胞內(nèi)脂質(zhì)含量增多，GRP78、PERK表達(dá)上調(diào);進(jìn)一步給予IL-1β刺激，其胞內(nèi)脂質(zhì)沉積、GRP78及PERK水平較單獨(dú)LDL刺激顯著增多，且胞內(nèi)脂質(zhì)水平與ERS狀態(tài)呈正相關(guān)。提示脂質(zhì)在HMCs的異常沉積，可啟動(dòng)ERS-UPR，從而激活下游 PERK信號(hào)通路，導(dǎo)致細(xì)胞損傷;而炎癥可加重該效應(yīng)。

ERS-UPR啟動(dòng)后可激發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高爾基體、細(xì)胞核之間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。NF-κB是一種廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)的重要轉(zhuǎn)錄因子，可促進(jìn)炎癥反應(yīng)、應(yīng)激、細(xì)胞增殖與凋亡等。ERS啟動(dòng)下游不同的信號(hào)通路介導(dǎo)NF-κB的激活可能與不同刺激劑、不同細(xì)胞種類(lèi)及種屬相關(guān)［4］，存在組織器官的特異性。如:毒胡蘿卜素在人胚腎細(xì)胞中通過(guò)需肌醇酶1和腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子2激活NF-κB［11］，小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中，磷酸化的eIF2α對(duì)激活NF-κB轉(zhuǎn)錄活性必不可少［12］。目前，高脂能否通過(guò)ERS-UPR信號(hào)通路活化NF-κB p65致HMCs損傷的相關(guān)研究甚少。本研究發(fā)現(xiàn)高脂聯(lián)合炎癥狀態(tài)下，HMCs PERK、NF-κB p65及IL-6水平均較單純高脂狀態(tài)下顯著增高;且脂質(zhì)沉積與 GRP78-PERK軸、NF-κB p65及 IL-6水平呈正相關(guān)。因此，我們推測(cè)本實(shí)驗(yàn)中HMCs NF-κB p65水平增加可能與ERS下游GRP78-PERK信號(hào)通路活化相關(guān)，進(jìn)而增加炎癥因子(如IL-6)的分泌，形成惡性循環(huán)，擴(kuò)大腎臟局部炎癥反應(yīng)。

α-SMA是HMCs表型轉(zhuǎn)化的重要分子標(biāo)記［13］。在高糖誘導(dǎo)HMCs ERS模型中，其表達(dá)顯著上調(diào)［14］。在系膜增殖性腎炎中，HMCs的增殖、細(xì)胞外基質(zhì)的積聚與α-SMA的表達(dá)，三者呈平行變化并具有高度相關(guān)性。我們發(fā)現(xiàn)在高脂誘導(dǎo)的HMCs ERS模型中，α-SMA mRNA水平明顯上調(diào)，通過(guò)干預(yù)ERS，可使其表達(dá)下調(diào)。提示ERS在高脂介導(dǎo)的HMCs表型改變中發(fā)揮重要作用。

4-PBA是人工合成小分子化合物，在穩(wěn)定內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)構(gòu)象、改善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)折疊能力、運(yùn)輸突變蛋白等方面發(fā)揮作用，能有效緩解ERS的發(fā)生，是ERS的一種常用阻斷劑。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)4-PBA干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，4-PBA可通過(guò)降低分子伴侶GRP78及PERK的表達(dá)以達(dá)到緩解ERS發(fā)生的強(qiáng)度，從而降低其介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)、抑制HMCs表型轉(zhuǎn)化等細(xì)胞損害。同時(shí)在本實(shí)驗(yàn)中還意外的發(fā)現(xiàn)，4-PBA亦能顯著降低HMCs胞內(nèi)脂質(zhì)沉積水平，但其具體分子機(jī)制尚不清楚。其是否在調(diào)控HMCs內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上脂質(zhì)代謝相關(guān)蛋白及轉(zhuǎn)運(yùn)膽固醇合成蛋白等方面發(fā)揮作用，還有待進(jìn)一步的研究。這一發(fā)現(xiàn)有可能為干預(yù)脂質(zhì)代謝紊亂介導(dǎo)的一系列病理生理改變提供新的治療靶點(diǎn)及干預(yù)手段。