張素珍，李思施，韋婷婷，張 凱，關家偉，吳大暢

(大連醫(yī)科大學生物技術系，遼寧 大連 116044)

哺乳動物腸道內細菌組成非常復雜。近年來，腸道菌群對機體健康和疾病的影響越來越受到人們的關注［1-2］，糞便與腸道內容物相似，含有大量的微生物、未消化食物和腸道脫落細胞等［3］，糞便微生物的變化可以間接地反映腸道微生物的變化。糞便分析技術不同于采血或取組織獲取樣本，屬于非損傷性取樣，應用性強［4］。在腸道菌群數(shù)量和種類鑒定過程中，因厭氧菌占多數(shù)，難以利用傳統(tǒng)的選擇培養(yǎng)法進行培養(yǎng)，因此無法對其深入研究［5］。近年來，分子微生態(tài)學技術被廣泛應用于腸道菌群多樣性研究中，變性梯度凝膠電泳(DGGE)通過遞增的化學變性劑濃度梯度把長度相同堿基組成不同的DNA片段區(qū)分開。該法可有效避免在傳統(tǒng)富集、培養(yǎng)、分離研究過程中造成的微生物多樣性丟失，能夠更直接、可靠地反映出微生物原始組成情況［6］。然而能否獲得高濃度、多樣性程度高、具有代表性的微生物基因組DNA對后續(xù)的PCR及DGGE分析具有至關重要的作用。糞便中大量食物殘渣、組織脫落物和各種消化道成分的存在，對微生物DNA的提取造成很大困難。目前糞便微生物細胞的裂解方法主要有化學裂解法、物理裂解法、酶解法［7］。不同方法對微生物細胞的裂解程度不盡相同，可根據(jù)實驗目的的不同將以上方法有機結合以達到最佳結果。本研究在總結以往報道的基礎上，對4種小鼠糞便微生物總DNA提取方法進行比較和研究，進一步加以改進，摸索出適用于小鼠糞便細菌基因組DNA提取的有效方法，旨在為后續(xù)基于PCR擴增及DGGE分析腸道菌群結構提供前提基礎和實驗保障。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 SPF、BALB/C小鼠由大連醫(yī)科大學實驗動物中心提供，3周齡，體重18～22 g。肛門直接收集糞便樣品于滅菌Ep管中，備用。

1.1.2 主要試劑及儀器 PCR引物由大連寶生物公司合成，Ex Taq DNA聚合酶購自大連寶生物公司，糞便DNA提取試劑盒(市售，中國)。丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺購自美國Sigma公司，去離子甲酰胺購自上海生物化學試劑工程公司。DCode變性梯度凝膠電泳系統(tǒng)(大連競邁生物科技有限公司)，TDL5M臺式低速大容量冷凍離心機(長沙湘智離心機儀器有限公司)、空氣恒溫搖床 KYC-100B、Thermo PCR 循環(huán)儀(PXE 0.2 Thermal Cyder)、PHs-3C精密pH計(上海精密科學儀器有限公司)，超微量分光光度計(NanoVue，USA)。

1.2 方法

1.2.1 糞便樣品總DNA的提取 ①基于SDS的裂解法［8-9］(方法Ⅰ):取糞便樣品0.2 g于盛有2 mL PBS的離心管中，混勻，3000 r/min離心10 min，重復1次。加入1.5 mL的DNA提取液(100 mmol/L Na2EDTA，100 mmol/L 磷酸鈉，100 mmol/L Tris-HCl，1.5 mol/L NaCl，1%CTAB，pH 8.0)和5 μL蛋白酶K(40 mg/mL)于37℃搖床中140 r/min，1 h;加入115 μL 20%SDS，65 ℃水浴2 h(每隔15～20 min輕搖1次)，于室溫4000 r/min離心10 min，取上清。再向沉淀中加入720 μL DNA提取液、2 μL 蛋白酶 K 及 80 μL 20%SDS，漩渦震蕩10 s，65℃水浴10 min，4000 r/min離心10 min，取上清?；旌?次上清液;②市售國產(chǎn)試劑盒提取DNA(方法Ⅱ):嚴格按照試劑盒操作說明規(guī)范操作;③改進的化學裂解法 (方法Ⅲ):稱取0.2 g小鼠糞便，加入1 mL PBS，漩渦震蕩，充分混勻后，200×g離心5 min，取上清。重復1次，混合上述2次上清，300×g離心5 min。將上清轉移到新的Ep管中，10000 r/min離心8 min，沉淀菌體。將所得的菌體用1 mL PBS洗滌2～3次(至上清無色)，－20℃保存?zhèn)溆谩Ｏ駿p管中加500 μL DNA 提取液(同①)，6 μL 蛋白酶 K(40 mg/mL)37℃、140 r/min搖床振蕩1 h左右，再加入56 μL 20%SDS，65℃水浴2 h(每隔15～20 min輕搖1次);④改進的溶菌酶法［10］(方法Ⅳ):同③的方法沉淀菌體。參考改進溶菌酶法［10］，稍作改動。方法Ⅰ和Ⅲ得到的細胞裂解液均用等體積的酚/氯仿(Tris-飽和酚∶氯仿∶異戊醇=25∶24∶1)進行抽提2～3次，以除蛋白，以0.6倍體積的異丙醇于室溫下沉淀DNA，12000r/min離心10 min，75%乙醇洗滌沉淀，DNA沉淀自然干燥后溶于TE(加RNAse)溶液中并于37℃溫箱中放置30 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.2 16S rDNA V3區(qū)的 PCR擴增 以上述DNA提取液為模板擴增所有細菌16S rDNA基因的V3可變區(qū)。根據(jù)文獻［11］設計引物及擴增體系。PCR反應程序:預變性94℃ 5 min;變性94℃ 30 s，退火54℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，30個循環(huán);72℃ 延伸7 min。擴增結果1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.3 PCR反應產(chǎn)物的變性梯度凝膠電泳(DGGE)分析 35% ～55%的變性范圍，60℃恒溫水浴，電壓50～60 V，電泳4 h。電泳完畢后，EB染色30 min，觀察并拍照。利用Gel-Pro analyzer(灰度分析)軟件分析DGGE圖譜。獲得各泳道內各條帶的IOD，然后利用Shannon-Weaver index(H’)計算條帶的多樣性［12］。并采用均勻度Evenness(E)分析菌群分布的統(tǒng)一性。H’和E通過以下公式獲得:

Shannon-Weaver index(H’)=－∑(Pi)(ln Pi);Evenness(E)=H’/InS Pi=ni/N，其中ni為單個條帶的灰度值，N為所有條帶的灰度值，S為樣品條帶數(shù)。

2 結果與分析

2.1 4種方法提取DNA質量的比較

2.1.1 瓊脂糖凝膠電泳檢測結果 4種方法對同一糞便進行DNA提取的瓊脂糖凝膠電泳檢測結果見圖1。方法Ⅰ和方法Ⅱ所得DNA提取液在20 kb左右均未見清晰條帶，提示未能成功提取細菌基因組總DNA。而方法Ⅲ和Ⅳ在目標位置可見清晰條帶。圖中泳道1～3、7、8主條帶亮度雖較高，但有少許彌散，說明DNA提取率高但純度不夠，泳道4～6條帶亮度雖不高，但泳道清晰，無彌散。2種方法均成功地提取了細菌基因組。

圖1 糞便細菌總DNA提取的瓊脂糖凝膠電泳檢測Fig.1 Agarose gel electrophoresis detection of total DNA from fecal bacteria

2.1.2 方法Ⅲ和Ⅳ 兩種方法所得DNA的純度和濃度比較 OD260nm/OD280nm能夠反映DNA的純度，正常 OD260nm/OD280nm值約為 1.8 ～2.0。若OD260nm/OD280nm值小于1.8或大于2.0說明可能有蛋白質或RNA污染［10］，2種DNA提取法獲得DNA的純度和濃度見表1。

表1 DNA純度和濃度檢測結果Table 1 Detection of DNA purity and concentration

2.2 細菌DNA的16S rDNA V3區(qū) PCR擴增結果

由于方法Ⅰ和方法Ⅱ未能成功提取到腸道菌群總DNA，故不能進行后續(xù)的PCR擴增，所以只對方法Ⅲ和方法Ⅳ所提取的細菌總DNA進行PCR擴增。由圖2可知，2種方法PCR產(chǎn)物的大小約為230 bp，說明由2種方法提取的DNA均可得到較理想的PCR結果。

圖2 PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結果Fig.2 Result of PCR amplication

2.3 菌群多樣性DGGE結果

在從糞便提取細菌總DNA的過程中不可避免地會使一些數(shù)量較少的劣勢菌丟失，造成菌群多樣性降低。DGGE圖譜能夠直觀地反映出菌群多樣性，進而判斷DNA提取方法的優(yōu)劣。由圖3分析得出，2種方法均能分離出糞便20余種細菌。

圖3 DGGE結果Fig.3 Result of DGGE

利用Gel-Pro analyzer(灰度分析)軟件分析DGGE膠圖及統(tǒng)計學分析數(shù)據(jù)所得的豐富度(S)、多樣性(H)及均勻性(E)的結果見表2。由表2可知，方法Ⅲ和方法Ⅳ的多樣性和均勻性均較好，但方法Ⅳ的豐富度更好。另外利用方法Ⅲ提取DNA的相同樣品之間的差異性較大，較方法Ⅳ的穩(wěn)定性差。

表2 DGGE圖譜多樣性分析結果Table 2 Diversity analysis of DGGE fingerprinting

3 討論

糞便中含有較多雜質，在糞便微生物DNA提取過程中，未消化的食物殘渣、黏液、消化酶等雜質可能會導致DNA降解或后續(xù)PCR反應抑制物的產(chǎn)生。因此，在動物糞便微生物總DNA提取時，保證DNA的純度和濃度是提取技術的關鍵。目前，各種提取糞便細菌總DNA的方法均是圍繞如何去除這些雜質和抑制物進而得到高純度且足夠量的目的基因而展開［13］。在化學裂解法裂解微生物細胞過程中，通常包括能夠攻擊細菌細胞壁和除去細胞膜的2種成分，從而暴露DNA。溶菌酶和乙二胺四乙酸鹽(EDTA)通常用于削弱細胞壁的作用，去垢劑如十二烷基硫酸鈉(SDS)來破壞細胞膜，協(xié)助整個細胞外壁的裂解過程［14］。另外陽離子表面活性劑十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)主要功能是分解多糖，破壞細胞壁完整性。在DNA提取中常用的蛋白酶K能夠降解蛋白，使DNA充分游離。

本實驗采用基于SDS的裂解法(Ⅰ)、國產(chǎn)市售試劑盒(Ⅱ)、改進的化學裂解法(Ⅲ)和改進的溶菌酶法(Ⅳ)四種方法分別對小鼠糞便細菌總DNA進行了提取，其中方法Ⅲ是在方法Ⅰ的基礎上改進而來。方法Ⅰ和方法Ⅱ是直接在糞便中加入細胞裂解液，而方法Ⅲ和方法Ⅳ則是先將微生物從糞便雜質中分離除雜后再裂解微生物細胞。從DNA提取結果可以看到，先分離后裂解的效果優(yōu)于直接裂解細胞。本研究還發(fā)現(xiàn)，分離除雜后的微生物細胞經(jīng)過反復凍融后再進行裂解的DNA提取效果較分離除雜后直接裂解效果好。在方法Ⅰ和方法Ⅲ中:通過EDTA、CTAB及蛋白酶K的配合使用，達到破碎微生物細胞，獲取游離DNA的目的。方法Ⅳ則利用溶菌酶破壞細胞壁。從DNA提取的濃度和純度上看，方法Ⅲ提取的DNA純度高于方法Ⅳ，但DNA的濃度卻低于方法Ⅳ。OD260nm/OD280nm顯示方法Ⅲ所得DNA提取液中含有一定量的RNA雜質，而方法Ⅳ則含有蛋白質污染。但2種方法得到的總DNA均能成功地進行后續(xù)PCR擴增，且變性梯度凝膠電泳圖譜中清晰地分出了20多種不同的條帶。除多樣性和均勻性相似外，方法Ⅳ的豐富度和穩(wěn)定性更佳。

目前多數(shù)實驗室采用市售試劑盒提取糞便菌DNA，效果雖好但價格昂貴，而常規(guī)的傳統(tǒng)DNA提取方法步驟多、耗時長，且提取質量不佳，二者均不適合基層實驗室大批量分析使用，故如何利用分子生物學常規(guī)試劑建立糞便細菌總DNA提取的穩(wěn)定、經(jīng)濟、快捷的方法，并能夠適用于下游PCR-DGGE分析具有重要的實踐和經(jīng)濟意義。本研究中的方法Ⅲ和Ⅳ利用實驗室常規(guī)試劑完成了對腸道菌群總DNA的較高質量的提取，成本低且重復性好，具有較強的實用價值，為研究腸道菌群的結構提供了基礎，值得實驗室深入推廣。

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