劉丹丹，恩特馬克·布拉提白，楊振龍，吾魯木汗·那孜爾別克

(吉首大學(xué)生物資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，湖南 吉首 416000)

丹毒絲菌根據(jù)DNA-DNA雜交和PCR分為紅斑丹毒絲菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)和扁桃體丹毒絲菌(E.tonsillarum)，前者有 1a、1b、2、4、5、6、8、9、11、12、15、16、17、19、21 和 N 等 16 種血清型，后者有 3、7、10、14、20、22 和 23 等 7 種血清型，另外還有分類地位未確定的血清型13和18的菌株，但它們?cè)谶z傳發(fā)育上屬于丹毒絲菌屬［1］。其中紅斑丹毒絲菌是豬丹毒、禽類的敗血癥、人類丹毒、魚類的臟器出血和腎臟腫大等疾病的致病菌，給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，也給人民的食品衛(wèi)生和人體健康帶來威脅［2-4］。目前，預(yù)防豬丹毒的滅活苗和弱毒苗只能預(yù)防特急性、急性和風(fēng)疹性疾病，而無法預(yù)防該菌引起的慢性疾病，且在疫苗應(yīng)用中仍有疫情再次爆發(fā)，至今世界各地尚未徹底消滅本?。?-6］。因此，研究紅斑丹毒絲菌菌體表面的保護(hù)性抗原，為豬丹毒亞單位疫苗的研制提供理論依據(jù)。Kitajima等［7］用NaOH提取法制備血清型2紅斑丹毒絲菌的菌體表面蛋白并檢測其保護(hù)作用，結(jié)果表明該蛋白疫苗能保護(hù)SPF豬受同源菌株和異源菌株的致死性感染，并發(fā)現(xiàn)64～67 ku的菌體表面蛋白分別能與攻毒前免疫血清和康復(fù)期免疫血清發(fā)生特異性反應(yīng)，暗示了這些蛋白可能具有交叉保護(hù)作用。Galan和Timoney［8］用抗體從血清型1紅斑丹毒絲菌的基因組文庫中篩選出具有保護(hù)作用的2個(gè)克隆，并分別制備它們的抗體，Western blot結(jié)果顯示這些抗體分別能與豬丹毒絲菌的43、64和66 ku表面蛋白結(jié)合，表明這些蛋白可能是本菌保護(hù)性抗原。Makino等［9］用單抗從血清型2紅斑丹毒絲菌基因組文庫中克隆出編碼64 ku表面保護(hù)性抗原A(surface protective antigen A，SpaA)的全基因序列，用原核表達(dá)系統(tǒng)分別表達(dá)重組rSpaA和缺失C端8個(gè)重復(fù)序列的ΔSpaA，小鼠保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果顯示rSpaA能完全保護(hù)小鼠受強(qiáng)毒株Tama-96的致死性感染，而ΔSpaA免疫組小鼠攻毒后全部死亡，表明SpaA的保護(hù)作用與其C端的重復(fù)序列有關(guān)。Imada等［10］用PCR從血清型1紅斑丹毒絲菌Fujisawa基因組DNA中克隆出編碼SpaA蛋白N端342個(gè)氨基酸的spaA-N基因片段，用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了重組蛋白SpaA-N并檢測其保護(hù)作用，結(jié)果表明SpaA-N免疫組小鼠對(duì)同源菌株和異源菌株82-875攻毒的保護(hù)率均為100%。后來Shimoji等［11］為了確定 SpaA的免疫保護(hù)區(qū)域，用PCR從菌株Fijisawa基因組DNA中分別克隆出編碼信號(hào)肽除外的成熟SpaA和其C端8個(gè)重復(fù)序列的基因片段，用原核表達(dá)系統(tǒng)分別表達(dá)重組蛋白SpaA和SpaA-C，保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果表明SpaA免疫組小鼠和SpaA-C免疫組小鼠對(duì)同源菌株攻毒的保護(hù)率分別為100%和20%。吾魯木汗等［12］對(duì)血清型2紅斑丹毒絲菌C43311株spaA-N基因進(jìn)行了原核表達(dá)和純化，保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果表明重組SpaA-N免疫組小鼠對(duì)強(qiáng)毒株C43065攻毒的保護(hù)率為100%。上述國內(nèi)外研究結(jié)果表明，SpaA是紅斑丹毒絲菌的主要交叉保護(hù)性抗原，用SpaA可以研制豬丹毒的蛋白疫苗，但是關(guān)于其C端重復(fù)序列的保護(hù)作用還存在爭議。所以，本研究為了闡明SpaA的免疫保護(hù)區(qū)域，用大腸埃希菌原核表達(dá)系統(tǒng)分別表達(dá)血清型2紅斑丹毒絲菌C43065株的重組SpaA、SpaA-N和SpaA-C，并檢測了它們對(duì)小鼠的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 血清型2紅斑丹毒絲菌C43065株購自中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心;大腸埃希菌DH5α和BL21為本實(shí)驗(yàn)室保存;表達(dá)載體pET32a購自Novagen公司。

1.1.2 主要試劑及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 PCR擴(kuò)增試劑盒、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ、T4 DNA連接酶、膠回收試劑盒、質(zhì)粒 DNA提取試劑盒、DNA marker和Protein marker均為大連TaKaRa公司產(chǎn)品;Brain Heart Infusion(BHI)培養(yǎng)基為Difco公司產(chǎn)品;IPTG為Promega公司產(chǎn)品;Ni-IDA SefinoseTMkit、HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG、HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG、鄰苯二胺(DAB)均購于上海生工生物工程公司。5周齡雌性昆明白小鼠和新西蘭白兔購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的擴(kuò)增和克隆 根據(jù)紅斑丹毒絲菌 C43065株 spaA 基 因(AccessionNo.EF688017)和表達(dá)載體pET32a的多克隆位點(diǎn)，參照潘宏升等［13］介紹的方法設(shè)計(jì)PCR引物(表1)，引物由大連TaKaRa公司合成。用引物SpaA-1和SpaA-2經(jīng)PCR從C43065株基因組DNA中擴(kuò)增編碼信號(hào)肽除外的成熟SpaA的spaA基因，PCR擴(kuò)增程序:94℃ 5 min;94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃1.8 min;35個(gè)循環(huán);72℃ 10 min。用引物SpaA-3和 SpaA-4經(jīng) PCR從 C43065株基因組DNA中擴(kuò)增編碼SpaA蛋白N端342個(gè)氨基酸序列的spaA-N片段，PCR擴(kuò)增程序:94℃ 5 min;94℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1.2 min;35 個(gè)循環(huán);72℃10 min。用引物SpaA-5和 SpaA-6經(jīng)PCR從C43065株基因組DNA中擴(kuò)增編碼SpaA蛋白C端160個(gè)氨基酸(20個(gè)氨基酸的8個(gè)重復(fù)序列)序列的spaA-C片段，PCR擴(kuò)增程序:94℃ 5 min;94 ℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 50 s;35個(gè)循環(huán);72℃10 min。用膠回收試劑盒純化PCR產(chǎn)物，將PCR產(chǎn)物和表達(dá)載體pET32a分別用BamHⅠ/HindⅢ進(jìn)行雙酶切，用T4 DNA連接酶連接后轉(zhuǎn)化至感受態(tài)DH5α，菌液經(jīng)PCR驗(yàn)證為陽性者用試劑盒提取質(zhì)粒DNA，酶切，電泳鑒定，將陽性者進(jìn)一步測序。

表1 引物的序列、位置及擴(kuò)增片段的長度Table 1 Sequences and locations of the primers and length of expected fragments

1.2.2 重組蛋白的表達(dá)和純化 參照季愛加等［14］的方法對(duì)重組菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。將重組質(zhì)粒pET-spaA、pET-spaA-N和 pET-spaA-C分別轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21，菌液濃度培養(yǎng)至OD600值為0.6 時(shí)，0.3 mmol/L IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)4 h，用12.5%SDS-PAGE電泳檢測目的蛋白的表達(dá)。將重組菌擴(kuò)大培養(yǎng)并經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，離心收集菌體，PBS重懸后冰浴超聲破碎菌體，離心后的上清過濾，用 Ni2+離子親和層析柱純化重組蛋白，用PEG6000干粉對(duì)純化蛋白進(jìn)行濃縮并按Bradford法測定蛋白含量。

1.2.3 免疫血清的制備 將純化的重組蛋白SpaA、SpaA-N和SpaA-C分別與弗氏完全佐劑等體積混勻，背部皮下注射新西蘭白兔，注射劑量為200 μg/只;隔1周用重組蛋白和等體積弗氏不完全佐劑混合加強(qiáng)免疫2次。最后一次免疫后7 d經(jīng)頸動(dòng)脈采血及分離血清。按照Lo等［15］的方法用大腸埃希菌BL21菌體的超聲波破碎液從免疫血清中吸附除去針對(duì)大腸埃希菌抗原的抗體。

1.2.4 重組蛋白免疫原性的Western blot檢測按照Kitajima等［7］報(bào)道的NaOH抽提法制備紅斑丹毒絲菌C43065株的NaOH提取抗原。將重組SpaA、SpaA-N、SpaA-C和NaOH提取抗原經(jīng)SDSPAGE電泳分離后，通過半干式電轉(zhuǎn)儀將蛋白條帶轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉溶液4℃封閉過夜，與抗重組蛋白免疫血清(1∶500)室溫孵育2 h，然后與HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶1000)室溫孵育1 h，每步完成后均嚴(yán)格洗膜，最后加DAB顯色液顯色。

1.2.5 免疫保護(hù)試驗(yàn) 根據(jù)吾魯木汗等［12］檢測的紅斑丹毒絲菌C43065株對(duì)小鼠的LD50值(11 CFU)，確定本次小鼠免疫保護(hù)試驗(yàn)的攻毒劑量為250 LD50。將45只5周齡雌性昆明系小鼠隨機(jī)分為9組，5只/組。4組小鼠分別用重組 SpaA、SpaA-N、SpaA-C和NaOH提取抗原與弗氏完全佐劑以1∶1的比例進(jìn)行乳化后，經(jīng)背部皮下注射，50 μg/只;4 組小鼠分別用重組 SpaA、SpaA-N、SpaA-C和NaOH提取抗原與弗氏完全佐劑以1∶1的比例進(jìn)行乳化后，經(jīng)背部皮下注射，100 μg/只;剩余1組小鼠注射生理鹽水作為非免疫對(duì)照組。隔2周，用等劑量抗原和等體積的弗氏不完全佐劑混勻加強(qiáng)免疫2次，第3次免疫后2周，用250 LD50(2.73×103CFU)紅斑丹毒絲菌C43065株對(duì)各試驗(yàn)組小鼠進(jìn)行腹腔攻毒，連續(xù)觀察12 d，記錄各組小鼠死亡數(shù)，計(jì)算各免疫組的保護(hù)率。

1.2.6 攻毒前小鼠免疫血清的抗體效價(jià) 第3次免疫后7 d，用尾靜脈采血法從各試驗(yàn)組小鼠中采血及分離血清，用間接ELISA法檢測攻毒前小鼠血清的抗體效價(jià)。用0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液(pH 9.6)制備蛋白含量為100 μg/mL的重組SpaA溶液并包被ELISA板，4℃包被過夜，用含0.05%Tween20的PBS(PBS-T20)緩沖液洗滌3次，用含1%脫脂奶粉和1%BSA的PBS-T20封閉液于37℃封閉2 h，將待測的血清用封閉液進(jìn)行稀釋后加入ELISA板孔中，37℃孵育2 h，用PBST20緩沖液洗滌3次。將HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG用封閉液進(jìn)行1∶1000稀釋，加入ELISA板孔中并于37℃孵育1 h，用PBS-T20緩沖液洗滌3次，加入OPD顯色液室溫反應(yīng)30 min，加入2 mol/L H2SO4溶液終止反應(yīng)后，用酶標(biāo)儀測定OD492的吸光值，并用Fisher’s精確檢驗(yàn)分析各組小鼠血清抗體水平的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因的PCR擴(kuò)增

用引物對(duì)SpaA-1/SpaA-2、SpaA-3/SpaA-4和SpaA-5/SpaA-6經(jīng)PCR從紅斑丹毒絲菌C43065株基因組DNA中分別擴(kuò)增出大小約為1.8、1.0和0.48 kb的片段(圖1)，與預(yù)期的目的基因片段大小基本一致。

圖1 紅斑丹毒絲菌spaA基因及其N端序列和C端序列的PCR擴(kuò)增Fig.1 Amplification of the spaA gene and its N-terminal region and C-terminal region of E.rhusiopathiae by PCR

2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的酶切鑒定

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，用BamHⅠ和HindⅢ雙酶切重組質(zhì)粒pET-spaA、pET-spaA-N和pET-spaA-C 后觀察到大小約為 1.8、1.0 和 0.48 kb的DNA片段(圖2)，與預(yù)期值相符。DNA測序結(jié)果表明這3條DNA片段大小分別為1794、1029和480 bp，分別編碼597個(gè)氨基酸的成熟SpaA、342個(gè)氨基酸的N端保護(hù)序列SpaA-N和160個(gè)氨基酸的C端重復(fù)序列SpaA-C。

圖2 重組質(zhì)粒DNA的酶切鑒定Fig.2 Restriction analysis of recombinant plasmids digested with BamHⅠand HindⅢ

2.3 重組蛋白的表達(dá)和純化

將重組菌用0.3 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)4 h后，超聲波破碎菌體，離心收集上清，SDS-PAGE檢測目的蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示在重組菌pET-spaA/BL21、pET-spaA-N/BL21 和 pET-spaA-C/BL21的超聲波破碎液中分別觀察到分子量約為86、58和38 ku的蛋白條帶(圖3)。由于表達(dá)載體多克隆位點(diǎn)上游有一個(gè)Trx編碼序列(其產(chǎn)物分子量為20 ku)分別與SpaA、SpaA-N和SpaA-C融合表達(dá)，所以重組蛋白的分子量與理論值相符。采用鎳離子親和層析柱純化得到了重組蛋白SpaA、SpaA-N和 SpaA-C，表達(dá)量分別為 42%、45%和48%(圖3)。純化后重組蛋白 SpaA、SpaA-N、SpaA-C和NaOH提取抗原的含量分別為1.34、1.65、1.42 和 0.9 mg/mL。

圖3 SDS-PAGE檢測重組蛋白的表達(dá)和純化Fig.3 SDS-PAGE analysis of recombinant proteins and purified proteins

2.4 重組蛋白的免疫原性檢測

2.4.1 重組蛋白 SpaA的免疫原性 Western blot結(jié)果顯示(圖4)，抗重組SpaA免疫血清分別能與天然SpaA、重組SpaA、SpaA-N和SpaA-C發(fā)生特異性反應(yīng)。分別在64、86、58和38 ku處有4條明顯的蛋白條帶(圖4)，表明重組蛋白SpaA具有良好的免疫原性。

圖4 重組蛋白SpaA免疫原性的Western blot檢測Fig.4 Immunogenicity of recombinant protein SpaA by Western blot

2.4.2 重組蛋白SpaA-N的免疫原性 Western blot結(jié)果顯示(圖5)，抗重組SpaA-N免疫血清能與天然SpaA、重組SpaA和SpaA-N特異性結(jié)合，分別在65、86和58 ku處有3條明顯的蛋白條帶，但該免疫血清不能與38 ku的重組SpaA-C結(jié)合，表明重組蛋白SpaA-N具有良好的免疫原性和特異性。

圖5 重組蛋白SpaA-N免疫原性的Western blot檢測Fig.5 Immunogenicity of recombinant protein SpaA-N by Western blot

2.4.3 重組蛋白 SpaA-C的免疫原性 Western blot結(jié)果顯示(圖6)，抗重組SpaA-C免疫血清分別能與天然SpaA、重組SpaA和SpaA-C特異性結(jié)合，但該免疫血清不能與58 ku的重組SpaA-N結(jié)合，表明重組蛋白SpaA-C具有良好的免疫原性和特異性。

圖6 重組蛋白SpaA-C免疫原性的Western blot檢測Fig.6 Immunogenicity of recombinant protein SpaA-C by Western blot

2.5 攻毒前小鼠免疫血清的抗體效價(jià)

第3次免疫后7 d，各試驗(yàn)組小鼠經(jīng)尾靜脈采血及分離血清，以10 μg的重組SpaA為包被抗原，用間接ELISA檢測攻毒前各試驗(yàn)組小鼠血清的抗體效價(jià)。ELISA檢測結(jié)果表明，在不同免疫劑量的重組SpaA組、重組SpaA-N、重組SpaA-C組和NaOH提取抗原組小鼠血清中的抗體效價(jià)無顯著差異(P＜0.05)，表明它們均能刺激小鼠體液免疫系統(tǒng)產(chǎn)生較高水平的免疫抗體。

圖7 攻毒前小鼠血清抗體效價(jià)的間接ELISA檢測Fig.7 Antibody responses in the sera of mice immunized with NaOH-extracted protein，recombinant proteins SpaA，SpaA-N and SpaA-C

2.6 免疫保護(hù)試驗(yàn)

用不同類型的蛋白疫苗對(duì)小鼠皮下進(jìn)行3次免疫后，再用250 LD50的C43065株對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔接種感染。生理鹽水對(duì)照組和rSpaA-C組小鼠在攻毒后表現(xiàn)出虛弱、食欲下降、毛發(fā)起皺以及精神沉郁等癥狀，第2天開始死亡，到第6天全部死亡。NaOH提取抗原組、重組 SpaA組和重組SpaA-N組所有小鼠沒有出現(xiàn)嚴(yán)重的發(fā)病癥狀，表明重組SpaA和SpaA-N均能完全保護(hù)小鼠受強(qiáng)毒株C43065的致死性感染(表2)。本研究表明SpaA的保護(hù)作用與其N端的342個(gè)氨基酸序列有關(guān)，而與其C端的160個(gè)氨基酸序列無關(guān)。

表2 重組蛋白SpaA、SpaA-N和SpaA-C對(duì)小鼠的保護(hù)作用Table 2 Protections in mice by immunized recombinant proteins SpaA，SpaA-N and SpaA-C

3 討論

臨床研究表明，血清型1和2的紅斑丹毒絲菌是引起豬丹毒的致病菌，而其余血清型的紅斑丹毒絲菌在豬敗血癥、蕁麻疹、關(guān)節(jié)炎、淋巴結(jié)炎和心內(nèi)膜炎中偶爾出現(xiàn)［16-17］。因此，在國內(nèi)外用血清型1和2的菌株分別研制豬丹毒的弱毒苗和滅活苗，而這些疫苗只能預(yù)防特急性、急性和風(fēng)疹性疾病，但無法預(yù)防該菌引起的慢性疾病［5-6］。Wang等［18］的綜述中闡述血清型1和2紅斑丹毒絲菌菌體表面的43、64和66 ku蛋白在豬丹毒的免疫預(yù)防中發(fā)揮重要的作用。Imada等［10］和吾魯木汗等［12］的研究表明血清型1和血清型2紅斑丹毒絲菌SpaA的保護(hù)作用與其N端342個(gè)氨基酸序列有關(guān)，而Makino等［9］的研究表明血清型2菌株SpaA的保護(hù)作用與其C端的160個(gè)氨基酸序列有關(guān)。上述研究結(jié)果表明SpaA是本菌的主要交叉保護(hù)性抗原，可以作為預(yù)防豬丹毒的亞單位疫苗，但是關(guān)于其C端160個(gè)氨基酸序列的保護(hù)作用還存在爭議。所以，本研究為了闡明SpaA的保護(hù)區(qū)域，用大腸埃希菌表達(dá)系統(tǒng)分別對(duì)血清型2紅斑丹毒絲菌的SpaA及其N端342個(gè)氨基酸序列和C端160個(gè)氨基酸序列進(jìn)行表達(dá)和純化，并檢測它們對(duì)小鼠的保護(hù)作用。

小鼠保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果顯示重組SpaA和SpaA-N的保護(hù)率均為100%，而重組SpaA-C雖然具有較強(qiáng)的免疫原性但沒有保護(hù)作用。Shimoji等［11］報(bào)道的重組SpaA-C對(duì)小鼠的保護(hù)率為20%，但是表達(dá)的重組SpaA-C是一個(gè)由181個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的多肽，與本研究表達(dá)的重組SpaA-C有21個(gè)氨基酸的差異。推測Shimoji等報(bào)道的SpaA-C的20%保護(hù)率可能與其N端的21個(gè)氨基酸序列有關(guān)。后來Makino等［19］發(fā)現(xiàn)SpaA的結(jié)構(gòu)及其C端160個(gè)氨基酸序列(由20個(gè)氨基酸的8個(gè)重復(fù)序列)和肺炎鏈球菌膽堿結(jié)合蛋白之間有很高的同源性，而SpaA通過其C端重復(fù)序列能夠與枯草芽胞桿菌和肺炎鏈球菌等革蘭陽性菌細(xì)胞壁的脂磷壁酸(LTA)結(jié)合，這暗示了LTA-SpaA復(fù)合物可能在紅斑丹毒絲菌致病過程中發(fā)揮重要的作用。本研究結(jié)果表明SpaA-N可以作為預(yù)防豬丹毒的亞單位疫苗，但SpaA-C致病作用及其致病機(jī)理尚未清楚。

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