李 輝，卜祥龍，竇 爽，郭晏華，張 波，宋有濤*

(1.遼寧大學(xué) 生命科學(xué)院，遼寧 沈陽 110036;2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 大連 116600)

朊病毒是一類能引起瘋牛病、綿羊瘙癢癥和人克雅氏病等可傳染性海綿樣腦病的病原體，其致死率可達100%，迄今為止對于朊病毒疾病仍缺乏有效的治療藥物［1-2］。近年來，抗朊病毒藥物篩選是國際上的研究熱點。研究者通過構(gòu)建動物模型、動物細胞模型、無細胞模型和酵母模型在抗朊病毒候選藥物的篩選方面進行了大量研究，獲得了戊聚糖多硫酸酯、剛果紅、四磺酸基酞菁等幾十種具有抗朊病毒作用效果的化合物［3-5］。其中，Bach等［6］的研究結(jié)果顯示，一些天然藥物化學(xué)組成成分如芳香性生物堿啡啶及啡啶衍生物類具有明顯的抗朊病毒作用;另外，Rambold等［7］發(fā)現(xiàn)姜黃素和綠茶提取物中的主要多酚類物質(zhì)表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)和沒食子兒茶素沒食子酸酯(GCG)也具有一定的抗朊病毒效果。這暗示著在天然藥物領(lǐng)域可能存在一些具有抗朊病毒活性的活性物質(zhì)。在我國的中藥研究領(lǐng)域，研究發(fā)現(xiàn)一些草藥和幾百種藥方具有治療帕金森癥和阿爾茨海默癥的臨床效果［8-9］。這2種病癥都與朊病毒疾病有相似的分子機制，然而，有關(guān)中藥對酵母朊病毒影響的研究迄今鮮有報道。本文利用實驗室改良的ΔERG6酵母朊病毒［PSI+］細胞模型，選取淫羊藿、千年健、生龍齒、刺五加、竹茹、熟地黃6種對阿爾茨海默癥有一定療效的菊科中藥材作為研究材料。采取向酵母培養(yǎng)基中直接添加中藥生藥并滅菌處理的方式來研究中藥對酵母朊病毒聚集的影響，篩選出具有抗朊病毒作用的藥物。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 ΔERG6釀酒酵母 Saccharomyces cerevisiae:MATα kar1 SUQ5 ade2-1 his3Δ202 leu2Δ1 trp1Δ63 ura3-52 erg6::KanMX，［PSI+］，7796-A菌系。

1.1.2 培養(yǎng)基(w/v，%) ①1/2YPD液體培養(yǎng)基:酵母浸出粉0.5，蛋白胨2，葡萄糖2，pH 自然，注意葡萄糖分裝，在115℃高壓蒸汽滅菌25 min，4℃保存;②1/2YPD固體培養(yǎng)基:酵母浸出粉 0.5，蛋白胨2，葡萄糖 2，瓊脂粉 2，pH 自然，注意葡萄糖分裝，115℃高壓蒸汽滅菌25 min，4℃下保存;③YPAD固體培養(yǎng)基:酵母浸出粉1，蛋白胨2，腺嘌呤0.04，葡萄糖2，瓊脂粉2，pH 自然，注意葡萄糖分裝，115℃高壓蒸汽滅菌25 min，4℃保存;④SD固體培養(yǎng)基:YNB-AA 0.7，葡萄糖2，瓊脂粉2，pH自然，115℃高壓蒸汽滅菌25 min，注意葡萄糖分裝，待冷卻到65℃時，按實驗需要加入一定量的氨基酸及營養(yǎng)成分，其終濃度:Ade:20 mg/L，Ura:20 mg/L，Trp:20 mg/L，Leu:60 mg/L。輕輕搖勻后倒平板。

1.1.3 中藥生藥 淫羊藿、刺五加購于沈陽市東北大藥房;千年健、生龍齒、竹茹、熟地黃購于草到祁州方成藥店。

1.2 方法

1.2.1 含中藥提取液培養(yǎng)基的制備 中藥材經(jīng)過粉碎后，準確稱量中藥粉末10 g置于圓底燒瓶中，加入100 mL蒸餾水，在95℃回流提取3 h，抽濾并回收濾液;稱量濾液體積，添加1/2YPD液體培養(yǎng)基的各種成分配置成相當(dāng)于含中藥粉末的1/2YPD液體培養(yǎng)基。

1.2.2 淫羊藿醇提物的制備 淫羊藿經(jīng)過粉碎后，準確稱量中藥粉末30 g置于圓底燒瓶中，加入300 mL 95%乙醇，在95℃回流提取3 h，抽濾并回收濾液;減壓蒸發(fā)濃縮，濃縮液置于潔凈小瓶中，于60℃過夜干燥，30℃放置至恒重并稱量。用盡可能少量的5%DMSO溶解淫羊藿提取物，計算淫羊藿提取物的濃度為0.650 g/mL。

1.2.3 淫羊藿水提物的制備 淫羊藿經(jīng)過粉碎后，準確稱量中藥粉末30 g置于圓底燒瓶中，加入300 mL蒸餾水，在95℃回流提取3 h，抽濾并回收濾液;減壓蒸發(fā)濃縮，濃縮液置于潔凈小瓶中，于60℃過夜干燥，30℃放置至恒重并稱量。用盡可能少量的蒸餾水溶解淫羊藿提取物，計算淫羊藿提取物的濃度為0.425 g/mL。

1.2.4 遺傳表型實驗 ［PSI+］酵母細胞在24℃過夜活化培養(yǎng)后，調(diào)整菌液OD600至0.2左右，按10%接種量分別接種到含有指定化合物的1/2YPD液體培養(yǎng)體系，所有體系于24℃振蕩培養(yǎng)5 d，在培養(yǎng)時間內(nèi)間隔24 h更換培養(yǎng)基和化合物［10］。5 d后取培養(yǎng)液稀釋后涂布于1/2YPD固體平板，平板于24℃培養(yǎng)7 d，觀察菌落顏色變化，統(tǒng)計不同顏色菌落的比例。

2 結(jié)果與分析

2.1 6種中草藥對酵母朊病毒的影響

圖1 6種中草藥抗酵母朊病毒的活性Fig.1 The activity of six kinds of Chinese herbal medicine against yeast prions

本實驗室使用的［PSI+］酵母細胞ade2-1突變體中，ADE基因的翻譯被人為突變的終止密碼子阻斷，因此［psi-］酵母細胞在少量Ade培養(yǎng)基(1/2YPD)上形成紅色菌落，在缺乏Ade的選擇性培養(yǎng)基(-Ade SD)上不能生長;而［PSI+］酵母細胞在1/2YPD上形成白色的菌落，在-Ade SD上可以生長［11］。利用上述酵母朊病毒細胞獨特的遺傳表型，檢測淫羊藿、千年健、生龍齒、刺五加、竹茹、熟地黃6種中草藥對朊病毒［PSI+］的治愈效果(圖1)。

結(jié)果顯示，千年健、生龍齒、刺五加、竹茹、熟地黃等5種中藥在1～5 d內(nèi)都沒有出現(xiàn)紅色菌落，而淫羊藿在5 d時出現(xiàn)部分紅色菌落，為總菌落數(shù)的1%。從表型上看，淫羊藿作用后的紅色菌落初步被認為是治愈的［psi-］，白色菌落為未治愈的［PSI+］。

2.2 定量分析淫羊藿水提物、醇提物對酵母朊病毒的治愈效果

為了深入研究淫羊藿對酵母朊病毒的治愈作用，對淫羊藿進行了水提和醇提，然后分別研究了0.032、0.065、0.0975 g/mL 濃度下對酵母朊病毒治愈的表型分布。如表1所示，0.0975 g/mL的淫羊藿醇提取物作用于［PSI+］細胞1～3 d后沒有出現(xiàn)紅色菌落，但作用5 d后出現(xiàn)了紅色菌落，其比例為3%。由于淫羊藿醇提物的濃度大于0.0975 g/mL時有嚴重的抑菌作用，因此0.0975 g/mL是治愈的最佳濃度。而淫羊藿水提物并沒有治愈效果。

表1 淫羊藿醇提物、水提物對［PSI+］的治愈效果Table 1 Effect of curing［PSI+］by using alcohol extract and water extract of Herba Epimedii

2.3 影印培養(yǎng)法檢測淫羊藿醇提物對酵母朊病毒的作用效果

為了進一步驗證淫羊藿醇提物的治愈效果，以排除假陽性的可能性，本實驗利用影印培養(yǎng)法隨機選取最佳濃度治愈下紅色菌落，分別影印到Y(jié)PAD、SD-Ade和1/2YPD平板上。由圖2可以看出，被淫羊藿醇提物治愈的酵母細胞在1/2YPD培養(yǎng)基上為紅色，在YPAD為白色菌落，而在缺乏Ade的SD培養(yǎng)基上不生長。這說明淫羊藿醇提物對酵母朊病毒［PSI+］的治愈結(jié)果不是由基因突變引起的顏色指示系統(tǒng)變化，是可靠的。

圖2 影印培養(yǎng)法檢測淫羊藿醇提物作用效果Fig.2 Detect positive results in different mediums

2.4 淫羊藿治愈后酵母［psi-］表型的傳代穩(wěn)定性

酵母朊病毒［PSI+］經(jīng)淫羊藿治愈后形成的［psi-］表型在1/2YPD平板上生長為紅色菌落，其脫離藥物作用后可能會出現(xiàn)一些不穩(wěn)定的表型，研究淫羊藿醇提物最佳治愈濃度作用5 d后出現(xiàn)的紅色(R)菌落的傳代穩(wěn)定性。如圖3所示，紅色菌落傳代36代后表型仍然穩(wěn)定。這說明淫羊藿對酵母朊病毒［PSI+］的治愈是不可逆的。

圖3 分析治愈后菌落表型的傳代穩(wěn)定性Fig.3 Generation stability of colony phenotype

3 討論

利用ΔERG6酵母朊病毒［PSI+］細胞模型，從淫羊藿、千年健、生龍齒、刺五加、竹茹、熟地黃6種對阿爾茨海默癥有一定療效的菊科中草藥中篩選出具有抗酵母朊病毒作用的淫羊藿，進一步的研究發(fā)現(xiàn)只有淫羊藿醇提物對酵母朊病毒具治愈作用。定量分析顯示，淫羊藿醇提物的最佳治愈濃度為0.0975 g/mL，治愈率可達到3%。

據(jù)《中國藥典》記載，淫羊藿性味辛、甘、溫，歸肝、腎經(jīng)，具有溫心陽、通心脈、化淤血等功效［12］。淫羊藿的主要成分是淫羊藿苷類、生物堿、黃酮類等，此類成分易溶于水、甲醇、乙醇等溶媒。結(jié)合此前發(fā)現(xiàn)的啡啶等芳香性生物堿的抗朊病毒作用，推測淫羊藿中的抗朊病毒的活性物質(zhì)為生物堿類，但這需要下一步更精細的分離純化研究的驗證。

近20年來，研究者發(fā)現(xiàn)在酵母中至少存在8種安全無害的朊病毒［PSI+］、［URE3］、［PIN+］、［NU+］、［SWI+］、［OCT+］、［MOT3+］和［NSI+］，而且還發(fā)現(xiàn)了在釀酒酵母(S.cerevisiae)中存在19種具有朊病毒性質(zhì)的蛋白。對比哺乳動物朊病毒，酵母朊病毒具有很多優(yōu)點，因而在朊病毒的發(fā)生機理和抗朊病毒藥物的篩選研究上倍受重視?；?Wickner等發(fā)現(xiàn)酵母攜帶［PSI+］、［URE3］等與動物朊病毒聚集、傳播機制相似的朊病毒，這些朊病毒具有各自的表型特征，Lindguist等進一步驗證了酵母朊病毒對于動物細胞及個體的安全性，并發(fā)現(xiàn)酵母細胞具有與哺乳類細胞相似的朊病毒形成的胞內(nèi)環(huán)境。2003年Blondel等利用野生型酵母朊病毒［PSI+］、［URE3］細胞為模型，在2500多種化學(xué)藥物中篩出了6種抗酵母朊病毒聚集的化合物，并證明這些化合物在動物細胞中對于動物朊病毒同樣有抗聚集作用。而且還證實了部分對哺乳動物朊病毒有效的朊病毒同樣對酵母朊病毒具有一定的治愈效果。

朊粒的發(fā)現(xiàn)是繼艾滋病病毒之后對人類提出的又一巨大挑戰(zhàn)。目前，人們對這類傳染性中樞神經(jīng)機能退化癥還缺乏有效的診斷和治療手段。因此，朊粒病的預(yù)防顯得尤為重要?？砂磦魅静〉囊筮M行預(yù)防:①消滅已知感染的哺乳動物 ，對人進行適當(dāng)?shù)母綦x;②禁止食用可能污染的食物，對神經(jīng)外科的操作器械進行嚴格處理，對器官移植要排除患朊粒病的可能;③對家族性疾病的家屬應(yīng)注意防止接觸［13］。

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