潘 欣，蔡家麟，王 穎，陳建霞，曾思良，方 偉，陳 敏，廖萬(wàn)清，余秀珍，張 俊，宋 維

(1.上?？【S寓醫(yī)館，上海 200433;2.第二軍醫(yī)大學(xué)，上海 200433;3.上海交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，上海 200025;4.上海市肺科醫(yī)院，上海 200433)

由重鏈可變區(qū)結(jié)合抗原的單一結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的抗體稱為單域重鏈抗體(variable domain of the heavy-chain of heavy-chain antibody，VHH)，VHH具有分子量小、穩(wěn)定性高、體內(nèi)組織滲透性好、可溶性好、易表達(dá)、抗原識(shí)別表位獨(dú)特等特性［1］，在胞內(nèi)應(yīng)用作為治療性抗體中和病原體抗原、提高巨噬細(xì)胞殺菌的潛力日漸凸顯。結(jié)核分枝桿菌H37Rv菌株中的Rv0733抗原基因名為adk，抗原名為腺苷酸激酶，分子量約20.09 ku，對(duì)該菌在細(xì)胞內(nèi)的核苷酸代謝發(fā)揮作用［2］。本研究以已純化的原核表達(dá)的Rv0733-6His融合抗原［3］為包被抗原，從課題組已構(gòu)建達(dá)到109的羊駝非免疫單域重鏈抗體庫(kù)［4］中篩選針對(duì)該抗原的特異性重鏈可變區(qū)抗體，并構(gòu)建 VHH-FC人源化抗體，通過(guò)ELISA和Western的方法驗(yàn)證其親和力。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒、菌株、抗原與細(xì)胞 pCANTAB5E質(zhì)粒和輔助噬菌體M13KO7為美國(guó)Amersham Biosciences公司產(chǎn)品;攜帶人Fc片段的pET-22b-IFH質(zhì)粒、攜帶pCANTAB5E-VHH噬菌體抗體庫(kù)的大腸埃希菌TG1菌株、XL1-Blue菌株、60 ku-6His、Rv0733-6His融合抗原和人白血病單核THP-1細(xì)胞為上海交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院王穎課題組保存。牛型結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium bovis)、無(wú)毒疫苗株卡介苗(Bacille Calmette-Guerin，BCG)為上海市肺科醫(yī)院保存。BL21(DE3)PLySs感受態(tài)細(xì)胞為日本TaKaRa公司產(chǎn)品。

1.1.2 主要試劑與儀器 辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記的鼠抗噬菌體M13主要衣殼蛋白單克隆抗體為美國(guó)GE Healthcare公司產(chǎn)品，HRP標(biāo)記的山羊抗人IgG二抗和鍵合了Alexa 594的羊抗人IgG為美國(guó)Jakson公司產(chǎn)品，IRDye 700羊抗人IgG(H+L)紅色熒光二抗為美國(guó)Licor Biosciences公司產(chǎn)品，質(zhì)粒抽提試劑盒和膠回收試劑盒為美國(guó)Axygen公司產(chǎn)品，限制性內(nèi)切酶為美國(guó)New England Biolabs公司產(chǎn)品，2×聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)預(yù)混試劑為日本TaKaRa公司產(chǎn)品，異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、His-Select鎳親和瓊脂糖微珠和佛波酯(phorbol myristate acetate，PMA)為美國(guó) Sigma公司產(chǎn)品，16%多聚甲醛為美國(guó)Polysciences公司產(chǎn)品，Image-iT FX信號(hào)增強(qiáng)劑為美國(guó)Invitrogen公司產(chǎn)品。3 ku超濾離心管為美國(guó)Millipore公司產(chǎn)品，Olympus IX81熒光顯微鏡購(gòu)于日本Olympus公司，Odyssey雙色紅外熒光成像系統(tǒng)購(gòu)于美國(guó)Licor Biosciences公司。

1.2 方法

1.2.1 噬菌體VHH抗體庫(kù)的制備 取1 mL攜帶pCANTAB5E-VHH噬菌體抗體庫(kù)的凍存TG1菌液，在400 mL 2×YTAG培養(yǎng)基中37℃振搖培養(yǎng)至A600為0.6。按 MOI=20∶ 1的比例加入輔助噬菌體M13KO7，最終濃度為1010pfu/mL，室溫靜置20 min。37℃振搖培養(yǎng)1 h，加入卡那霉素至終濃度為50 μg/mL，并加IPTG至終濃度為0.1 mmol/L。于30℃振搖培養(yǎng)10 h。4℃、8000 r/min離心10 min，收獲培養(yǎng)上清，加入1/5體積預(yù)冷的含20%PEG 8000的2.5 mol/L NaCl溶液混勻，冰浴60 min。4℃、12000 r/min離心20 min，棄上清，噬菌體沉淀重懸于PBS緩沖液中，即為VHH抗體庫(kù)溶液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 噬菌體VHH抗體庫(kù)的篩選 將Rv0733-6His融合抗原用pH 9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋為10 μg/mL，以1 mL包被免疫管，4℃過(guò)夜。PBS洗3次后，用含2%BSA的PBS于37℃封閉1 h。將1 mL噬菌體抗體庫(kù)加至封閉后的免疫管中，37℃結(jié)合1 h。用PBST(含0.05%Tween20的PBS)洗10次，PBS洗5次。分2次洗脫，每次加入1 mL 甘氨酸洗脫緩沖液(0.1 mol/L HCl，0.2 mol/L甘氨酸，pH 2.2)，室溫?fù)u動(dòng)10 min，吸出洗脫液，用1 mol/L Tris中和至pH 7.4。吸出洗脫液合并于4℃保存。將洗脫的噬菌體用10倍體積的XL1-Blue菌室溫感染30 min，轉(zhuǎn)入37℃振搖培養(yǎng)1 h，離心，棄上清，用原培養(yǎng)基1/10體積的新鮮培養(yǎng)基重懸沉淀，取10 μL菌液做梯度稀釋，分別取 100 μL 梯度為 10－4、10－5、10－6和 10－7的菌液涂LB板，做2個(gè)復(fù)板，次日計(jì)數(shù)菌落形成單位(colony-forming unit，cfu)，計(jì)算得到的庫(kù)容。其余菌液涂于含10 μg/mL四環(huán)素和50 μg/mL氨芐青霉素的雙抗2×YTAG培養(yǎng)板，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。刮下的菌落一部分用于保留菌種，一部分按1.2.1方法制備VHH抗體庫(kù)溶液投入第2輪篩選。按照抗原包被濃度依次遞減(第2輪篩選所用抗原濃度為 5 μg/mL，第 3 輪為 2.5 μg/mL)的方法反復(fù)進(jìn)行3輪淘篩，隨機(jī)從每一輪篩選后的雙抗2×YTAG培養(yǎng)板上挑選20個(gè)克隆，送上海華津生物科技有限公司測(cè)序，以監(jiān)測(cè)篩選過(guò)程中插入片段終止密碼子出現(xiàn)的幾率，若超過(guò)50%則重新篩選。陽(yáng)性測(cè)序結(jié)果使用DNAMAN軟件進(jìn)行序列比對(duì)分析。

1.2.3 ELISA檢測(cè)單克隆VHH抗體的結(jié)合活性在2 mL規(guī)格的96孔培養(yǎng)板中，每孔加入300 μL 2×YTAG，挑單菌落接種各孔。封膜后，37℃靜置培養(yǎng)過(guò)夜。次日，取新的96孔板，各孔加入300 μL 2 ×YTAG，加入 50 μL(1∶7)過(guò)夜培養(yǎng)的菌液，37 ℃振搖培養(yǎng) 1 ～1.5 h 至 A600≈0.6。每孔加入50 μL含有M13KO7(滴度 ＞1012pfu/mL)的YT培養(yǎng)基，室溫靜置60 min，37℃ 振搖培養(yǎng)1 h，然后加入100 μL含終濃度為50 μg/mL卡那霉素和終濃度為0.1 mmol/L IPTG的2×YT培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)過(guò)夜。將96孔培養(yǎng)板呈現(xiàn)的噬菌體3300 r/min離心30 min。上清分別加入BSA至終濃度2%，Tween-20至終濃度0.1%，37℃靜置預(yù)封閉15 min，為預(yù)封閉的呈現(xiàn)Rv0733-VHH抗體的噬菌體。用1 μg/mL的Rv0733-6His融合抗原按100 μL/孔包被ELISA酶標(biāo)板，酶標(biāo)板僅包被PBS的孔設(shè)為空白對(duì)照，包被用pCANTAB5E制備的噬菌體的孔為陰性對(duì)照，4℃過(guò)夜;PBST洗后，每孔用200 μL含2%BSA 和0.1%Tween-20的PBS于37℃封閉1 h;PBST洗后，每孔加入100 μL預(yù)封閉的呈現(xiàn)Rv0733-VHH抗體的噬菌體，37℃孵育2 h;PBST洗后，每孔加入100 μL 1∶5000稀釋的HRP標(biāo)記的鼠抗M13二抗，37℃孵育1 h;洗板后，每孔加入100 μL鄰苯二胺(ophenylenediamine，OPD)底物，暗處顯色 30 min，每孔再加入50 μL 2 mol/L硫酸終止反應(yīng)，于490 nm測(cè)定OD值。實(shí)驗(yàn)組OD490值高于陰性組2.1倍以上為陽(yáng)性，保留對(duì)應(yīng)序號(hào)的菌株。

1.2.4 Rv0733-VHH抗體的人源化改造 用質(zhì)粒抽提試劑盒抽提經(jīng)Rv0733-6His抗原篩選到的陽(yáng)性菌株中的pCANTAB5E-VHH質(zhì)粒，并以此為模板用PCR方法擴(kuò)增其中的VHH片段。上游引物引入 NheⅠ酶切位點(diǎn)，序列為 TAATTAG CTAGCGGAGACGGTGACCTGGGT;下游引物引入BamHⅠ酶切位點(diǎn)，序列為 AATAAGGATCCGA TGGCCCAGGTGCAGCT。PCR反應(yīng)中 pCANTAB5E-VHH質(zhì)粒使用10 ng，反應(yīng)混合物中含1×聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)預(yù)混試劑和300 nmol/L上下游引物，反應(yīng)條件為94℃ 5 min;94℃ 30 s，55℃25 s，72℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收。應(yīng)用NheⅠ和BamHⅠ限制性內(nèi)切酶及DNA重組技術(shù)將酶切后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物插入攜帶人Fc片段和6His標(biāo)簽的酶切線性化的pET-22b-IFH載體中，構(gòu)建成 pET-22b-Rv0733-VHH-IFH原核表達(dá)載體，送上海華津生物科技有限公司測(cè)序，確認(rèn)讀框正確。

1.2.5 Rv0733-VHH-Fc-6His人源化融合抗體的原核表達(dá)與純化 攜帶pET-22b-Rv0733-VHHIFH質(zhì)粒的菌種接種200 mL LB培養(yǎng)基(含50 μg/mL氨芐青霉素)，37℃振搖至A600為0.6后，加入終濃度為0.1 mmol/L的IPTG，30℃振搖6 h，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。7000 g離心3 min，收集細(xì)菌沉淀;用20 mL細(xì)菌裂解液(50 mmol/L NaH2PO4，300 mmol/L NaCl，10 mmol/L 咪唑，pH 8.0)重懸菌體沉淀，超聲法充分裂解細(xì)菌;4℃ 8000 g離心30 min，取上清，為粗提蛋白，經(jīng) 0.45 μm 過(guò)濾器過(guò)濾后，加入1 mL鎳親和瓊脂糖微珠，4℃ 旋轉(zhuǎn)混合過(guò)夜;次日用含20 mmol/L咪唑的PBS緩沖液(50 mmol/L NaH2PO4，300 mmol/L NaCl，20 mmol/L咪唑，pH 8.0)充分洗滌，離心棄上清，以去除未與鎳親和瓊脂糖微珠結(jié)合或結(jié)合不緊密的雜蛋白;最后用含300 mmol/L咪唑的PBS緩沖液(50 mmol/L NaH2PO4，300 mmol/L NaCl，300 mmol/L咪唑，pH 8.0)洗脫目的蛋白。將洗脫純化的蛋白經(jīng)3 ku超濾離心管超濾，去除咪唑等小分子，再用0.22 μm過(guò)濾器濃縮過(guò)濾，濾液加入終濃度為40%的無(wú)菌甘油，制成純化Rv0733-VHHFc-6His蛋白樣品，置－80℃冰箱備用。

1.2.6 Rv0733-VHH-Fc-6His人源化融合抗體的鑒定 分別將粗提和純化后的融合抗體用Bradford方法進(jìn)行蛋白定量，取等量總蛋白進(jìn)行10%SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)G-250染色，評(píng)估純化前后的效果。Rv0733-6His和60 ku-6His融合蛋白經(jīng)12%SDS-PAGE電泳分離，電轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidenefluoride，PVDF)，用含3%BSA的PBS封閉液室溫緩慢振搖封閉1 h后，再與1∶1000稀釋的Rv0733-VHH-Fc-6His人源化融合抗體4℃孵育過(guò)夜。洗膜后與1∶5000稀釋的熒光標(biāo)記的IRDye 700羊抗人二抗室溫避光振搖孵育1 h。通過(guò)雙色紅外熒光成像系統(tǒng)掃描成像。

1.2.7 免疫熒光檢測(cè)Rv0733-VHH-Fc-6His與胞內(nèi)BCG的結(jié)合能力 將人白血病單核THP-1細(xì)胞以3×106細(xì)胞/孔的密度接種于放有無(wú)菌蓋玻片的6孔板內(nèi)，加入終濃度為50 ng/mL的PMA，孵育24 h后，THP-1細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞。培養(yǎng)于7H9液體培養(yǎng)基中的BCG用完全1640培養(yǎng)基洗后，用無(wú)菌玻璃珠充分研磨。以10∶1(細(xì)菌∶細(xì)胞)的比例用BCG感染分化后的THP-1細(xì)胞，在37℃ 5%CO2孵箱中放置10 h后，用PBS洗3次，4%多聚甲醛固定 30 min，PBS洗后，用含0.5%Triton X-100的 PBS透化30 min，用 ImageiT FX信號(hào)增強(qiáng)劑封閉30 min。PBS洗后，加入1∶500稀釋的Rv0733-VHH-Fc-6His一抗室溫孵育2 h。PBS洗后，加入1∶1000稀釋的鍵合了Alexa 594的羊抗人IgG二抗室溫孵育1 h。洗后干燥的爬片用含DAPI的中性樹(shù)膠在載玻片上裝片，指甲油封片。

2 結(jié)果與分析

2.1 羊駝非免疫重鏈單域抗體庫(kù)的篩選富集效果

用結(jié)核分枝桿菌Rv0733-6His融合抗原對(duì)羊駝非免疫重鏈單域抗體庫(kù)按抗原包被濃度依次遞減方法進(jìn)行3輪固相篩選，庫(kù)容量從109縮減為4×103，結(jié)合活性(OD 值)從 0.3 ～0.6 提升為2.5～2.8(表1)。為了動(dòng)態(tài)監(jiān)控篩選富集效果，在每輪篩選的文庫(kù)中隨機(jī)挑取20個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序，若陽(yáng)性克隆出現(xiàn)高于10個(gè)，并且終止密碼數(shù)量小于10%，則直接投入單克隆VHH抗體的ELISA結(jié)合活性篩選。ELISA篩選時(shí)設(shè)定陽(yáng)性孔OD值和陰性孔比值為2.1且陽(yáng)性孔讀數(shù)大于0.2、陰性孔讀數(shù)小于0.1為閾值，本研究從1024個(gè)克隆中篩選到13個(gè)陽(yáng)性克隆(有3個(gè)重復(fù)序列)共10個(gè)獨(dú)立序列(圖1)。

表1 羊駝非免疫重鏈單域抗體庫(kù)富集效果Table 1 Enriched effect of non-immune Llama variable heavy chain phage display antibody library

圖1 ELISA檢測(cè)與Rv0733-6His融合抗原有特異結(jié)合活性的VHH抗體分子Fig.1 ELISA detection the Rv0733-6His fusion protein binding specificity to the molecules of variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody

2.2 Rv0733-6His-VHH抗體的序列分析

將篩選得到的13個(gè)陽(yáng)性克隆用DNAMAN軟件進(jìn)行序列分析，結(jié)果提示篩選到的 Rv0733-6His-VHH抗體片段的長(zhǎng)度并不統(tǒng)一，長(zhǎng)短差異主要來(lái)自CDR3區(qū)的不同。13個(gè)陽(yáng)性克隆的DNA編碼序列的同源性分析見(jiàn)圖2，蛋白序列的同源性比對(duì)分析(重復(fù)的序列已被刪除)見(jiàn)圖3。

圖2 Rv0733-VHH噬菌體抗體庫(kù)中13個(gè)克隆DNA同源比對(duì)樹(shù)狀圖Fig.2 Phylogenetic tree of the genes of ten clones from Rv0733-VHH phage display library

圖3 Rv0733-VHH抗體庫(kù)中10個(gè)克隆編碼蛋白序列比對(duì)Fig.3 Amino acids sequence aligment of ten clones from Rv0733-VHH phage display library

2.3 Rv0733-VHH-Fc-6His人源化融合抗體的原核表達(dá)、純化及鑒定

圖4 SDS-PAGE檢測(cè)Rv0733-VHH-Fc-6His融合蛋白的表達(dá)和純化Fig.4 Expression and purification of Rv0733-VHH-Fc-6His fusion protein detected with SDS-PAGE

用質(zhì)粒抽提試劑盒抽提8c1號(hào)克隆的pCANTAB5E-VHH-8c1質(zhì)粒，PCR擴(kuò)增 VHH序列，經(jīng)NheⅠ/BamHⅠ酶切后插入用相應(yīng)酶切線性化的原核表達(dá)載體 pET-22b-IFH，轉(zhuǎn)化 BL21(DE3)PLySs感受態(tài)細(xì)菌，獲得重組融合蛋白R(shí)v0733-VHH-Fc-6His的原核表達(dá)載體pET-22b-Rv0733-VHH-IFH。取測(cè)序正確的單克隆菌種經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后大量表達(dá)。將細(xì)菌裂解上清及用鎳親和瓊脂糖微珠親和層析法純化的目的蛋白進(jìn)行10%SDS-PAGE電泳，結(jié)果可見(jiàn)相對(duì)分子質(zhì)量50 ku和60 ku附近的濃染條帶，與理論值(54.63 ku)大小相符(圖4)。

將Rv0733-6His和60 ku-6His融合蛋白進(jìn)行Western Blot檢測(cè)，由于IRDye 700羊抗人IgG二抗可與一抗的 Fc段結(jié)合，而 Rv0733-VHH-Fc-6His一抗可以與Rv0733-6His抗原結(jié)合，在20.93 ku的位置得到了目的條帶Rv0733-6His融合蛋白;由于60 ku處未顯示結(jié)合條帶，提示Rv0733-VHH-Fc-6His一抗不與60 ku-6His蛋白結(jié)合，也即篩選表達(dá)純化的Rv0733-VHH-Fc-6His抗體具有Rv0733抗原結(jié)合專一性，未顯示與6His標(biāo)簽結(jié)合的特異性(圖5)。

圖5 Rv0733-VHH-Fc-6His抗體的抗原結(jié)合特異性檢測(cè)Fig.5 Analysis the specificity of Rv0733-VHH-Fc-6His antibody binding with target antigen

2.4 Rv0733-VHH-Fc-6His可與吞入胞內(nèi)的BCG結(jié)合

由于結(jié)核分枝桿菌和卡介苗(BCG)均可表達(dá)Rv0733，因此本研究選擇較為經(jīng)濟(jì)的BCG來(lái)驗(yàn)證Rv0733-VHH-Fc-6His的結(jié)合活性。THP-1細(xì)胞經(jīng)PMA誘導(dǎo)后發(fā)生巨噬細(xì)胞樣變化，可吞噬BCG活菌，經(jīng)10 h感染，可見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)發(fā)紅色熒光的BCG可與發(fā)藍(lán)色熒光的細(xì)胞核共定位。提示BCG表達(dá)在細(xì)菌表面的Rv0733可與純化的Rv0733-VHH-Fc-6His抗體結(jié)合(圖6)。

圖6 Rv0733-VHH-Fc-6His抗體可結(jié)合胞內(nèi)的BCGFig.6 Rv0733-VHH-Fc-6His binding with BCG in differentiated THP-1 cells

3 討論

本研究曾用Rv0733-6His抗原包被酶標(biāo)板分別檢測(cè)34例結(jié)核患者和35例健康體檢者血清，2組之間 t檢驗(yàn)無(wú)顯著差異(P=0.306)，提示Rv0733抗原(腺苷酸激酶)在結(jié)核患者體內(nèi)不能激發(fā)顯著的體液免疫，因此其雖然為膜抗原，但不適合用作臨床診斷標(biāo)志;然而由于結(jié)核分枝桿菌在宿主體內(nèi)主要寄居在巨噬細(xì)胞內(nèi)，該抗原對(duì)胞內(nèi)結(jié)核分枝桿菌核酸的生物合成起重要作用，本研究設(shè)想若能篩選到Rv0733抗原的VHH抗體，利用其分子量小、滲透能力強(qiáng)的特性［5］來(lái)中和胞內(nèi)菌產(chǎn)生的抗原，或可提高吞噬細(xì)胞清除胞內(nèi)菌的能力。

通常采用標(biāo)準(zhǔn)的免疫程序(完全和不完全弗氏佐劑先后與50 μg～1 mg免疫原混合分3～4次免疫動(dòng)物)免疫單只駱駝科動(dòng)物，可獲得滴度較好的特異性VHH［6］。受羊駝價(jià)格因素影響，本研究主要采用源自上海動(dòng)物園非免疫羊駝血液構(gòu)建的羊駝非免疫單域重鏈抗體庫(kù)。從非免疫動(dòng)物構(gòu)建的文庫(kù)中篩選到的VHH通常僅占免疫所得的10%［7］。由于本研究使用的噬菌體抗體庫(kù)存在無(wú)法預(yù)測(cè)的閱讀框和終止密碼，過(guò)多的終止密碼將阻止融合gⅢ基因的表達(dá)［8］，干擾VHH在噬菌體表面的展示。因此，為有效控制噬菌體抗體庫(kù)篩選過(guò)程中抗體片段終止密碼的大量增加，本研究將初始菌濃度調(diào)整為 A600在0.05～0.10之間，增菌時(shí)間控制在A600達(dá)到0.6，從而較好地把握了大庫(kù)容非免疫抗體庫(kù)篩選成功的關(guān)鍵，將富集的噬菌體克隆終止密碼控制在20%以內(nèi)。本研究從1024個(gè)克隆中篩選到10個(gè)長(zhǎng)短不同的獨(dú)立序列，其差異主要體現(xiàn)在VHH高度異變的CDR3區(qū)域序列長(zhǎng)短的不同。由于VHH缺乏CH1區(qū)，也即缺乏糖基化位點(diǎn)［9］，適合采用原核系統(tǒng)表達(dá)來(lái)探討VHH與傳統(tǒng)抗體差異顯著的CDR區(qū)的功能性折疊是否可與相關(guān)抗原結(jié)合。為便于純化、檢測(cè)并避免Rv0733-6His融合抗原中的6His標(biāo)簽在篩選過(guò)程中可能引發(fā)的非特異性結(jié)合對(duì)后續(xù)研究產(chǎn)生干擾，本研究選擇了攜帶有人Fc片段和6His標(biāo)簽的原核表達(dá)載體對(duì)篩選到的編號(hào)為8c1的克隆進(jìn)行了原核表達(dá)。免疫印跡結(jié)果提示，原核表達(dá)純化的Rv0733-VHH-Fc-6His融合抗體可以特異性地結(jié)合Rv0733-6His融合抗原，免疫熒光顯微結(jié)果提示該融合抗體可以與胞內(nèi)的BCG在細(xì)菌表面表達(dá)的Rv0733結(jié)合，提示從羊駝非免疫單域重鏈抗體庫(kù)中篩選到的Rv0733-VHH具備結(jié)合胞內(nèi)牛型結(jié)核分枝桿菌相關(guān)抗原的潛力。

Rv0733-VHH是否能在胞內(nèi)結(jié)合結(jié)核分枝桿菌相關(guān)抗原提高巨噬細(xì)胞除菌能力，還有待繼續(xù)深入研究。

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