黃惠琴，袁維道，王 英，魏 華，朱 軍，孫前光，鮑時翔

(中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所農(nóng)業(yè)部熱帶作物生物學(xué)與遺傳資源利用重點實驗室，海南 ?？?571101)

由根結(jié)線蟲(Meloidogyne spp.)危害植物根系引起的根結(jié)線蟲病是一種世界性的土傳病害，分布廣、危害大，給許多國家的農(nóng)林、園藝等產(chǎn)業(yè)造成巨大損失。我國熱帶、亞熱帶地區(qū)及寒帶溫室內(nèi)作物、蔬菜都有根結(jié)線蟲發(fā)生，一般造成減產(chǎn)10% ～20%，嚴(yán)重時減產(chǎn)達(dá)70%以上［1］。特別在南方熱帶、亞熱帶地區(qū)，病原線蟲無越冬現(xiàn)象，造成世代重疊和蟲口在土壤中的大量累積，繁殖系數(shù)極高，危害更為嚴(yán)重。對海南島的調(diào)查結(jié)果顯示，果樹中的香蕉、番石榴、番木瓜、胡椒以及幾乎所有的茄果類、豆類蔬菜均遭受到根結(jié)線蟲侵害，嚴(yán)重危害著農(nóng)業(yè)生產(chǎn)［2］。目前針對根結(jié)線蟲病害主要采用化學(xué)農(nóng)藥進行防治，造成的生態(tài)平衡破壞、水土污染等副作用日益嚴(yán)重，從微生物代謝產(chǎn)物中尋找具有根結(jié)線蟲拮抗活性物質(zhì)以開發(fā)生物農(nóng)藥越來越受到國內(nèi)外重視。紅樹林是生長在熱帶亞熱帶海岸潮間帶、受周期性海水浸淹、以紅樹植物為主體的潮灘濕地木本生物群落。作為四大海洋高生產(chǎn)力生態(tài)系統(tǒng)之一，其創(chuàng)造了豐富又極具特色的微生物資源，賦予了紅樹林微生物產(chǎn)生特殊活性物質(zhì)的潛在可能性，目前的研究主要集中在抗菌、抗腫瘤活性等方面，在抗根結(jié)線蟲方面，國內(nèi)外研究不多。本研究從紅樹林生態(tài)系統(tǒng)中采集樣品，分離篩選具有殺線蟲活性的放線菌資源，并對活性菌株進行分類鑒定，旨在為開發(fā)新型殺蟲生物農(nóng)藥提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 底泥樣品于2011年4月采集自海南省東寨港紅樹林。

1.1.2 培養(yǎng)基［3］放線菌分離培養(yǎng)基:高氏一號合成培養(yǎng)基、腐植酸-維生素培養(yǎng)基、酵母粉-淀粉培養(yǎng)基;形態(tài)特征鑒定培養(yǎng)基:高氏一號合成培養(yǎng)基、酵母粉-淀粉培養(yǎng)基、無機鹽淀粉培養(yǎng)基、甘油天門冬素培養(yǎng)基、燕麥汁培養(yǎng)基和土豆汁培養(yǎng)基;液體發(fā)酵培養(yǎng)基(%):玉米粉 1.0，酵母粉 0.1，黃豆粉 1.0，淀粉 0.5，KH2PO40.05 ，黃豆粉和玉米粉煮沸過濾，取汁，pH 7.2。所有培養(yǎng)基均用陳海水配制。

1.2 方法

1.2.1 放線菌分離 將底泥樣品自然風(fēng)干后待用。采用3種預(yù)處理方式:直接使用、55℃處理6 min、120℃干熱處理1 h。取適量土壤制成水懸液，用無菌陳海水分別稀釋至10－2、10－3，涂布到放線菌分離培養(yǎng)基，28℃倒置培養(yǎng)5～15 d，挑取單菌落于高氏一號培養(yǎng)基上劃線分離，獲得純培養(yǎng)。

1.2.2 發(fā)酵液制備 挑取純化后的放線菌單菌落，接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，28℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)7 d，10000 r/min 離心10 min，備用。

1.2.3 抗根結(jié)線蟲放線菌的篩選 ①供試線蟲:初篩時使用松材線蟲作為供試線蟲，以鐮刀菌培養(yǎng)［4］;復(fù)篩時使用花生根結(jié)線蟲(M.arenaria)，由采自胡椒根部的根結(jié)線蟲卵塊28℃孵化所得;②初篩:采用24孔板法篩選［5］。在24孔板中分別加入50 μL發(fā)酵液、550 μL無菌蒸餾水和400 μL(約200條)松材線蟲混懸液，混合均勻，28℃靜置24 h后用倒置顯微鏡觀察，僵直或卷曲不動的蟲體視為被擊倒，以發(fā)酵培養(yǎng)基為對照，每個處理重復(fù)3次，計算線蟲校正擊倒率。向24孔板中加入清水600 μL，觀察恢復(fù)情況，不能恢復(fù)活性的記為死亡，計算校正死亡率。

校正擊倒率(%)=100×(處理擊倒率－對照擊倒率)/(1－對照擊倒率)

校正死亡率(%)=校正擊倒率×(1－恢復(fù)率);③復(fù)篩:對初篩時校正死亡率在50%以上的菌株，使用花生根結(jié)線蟲進行復(fù)篩，方法同1.2.3中②。

1.2.4 放線菌的分類鑒定 ①形態(tài)與培養(yǎng)特征:采用平皿插片法［6］，28℃培養(yǎng)1～2周，觀察菌株基內(nèi)菌絲、氣生菌絲、有無色素產(chǎn)生等特征，在顯微鏡和掃描電鏡下觀察菌絲及孢子形態(tài);②生理生化特征:生理生化特征鑒定參照文獻［7］的方法進行;③16S rDNA序列測定及其系統(tǒng)發(fā)育分析:用試劑盒法提取菌株基因組DNA。以提取的DNA為模板，擴增引物為通用引物27f(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492r(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')。PCR反應(yīng)條件:94 ℃ 5 min;94 ℃ 1 min，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個循環(huán);72℃ 10 min，4℃保存。PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測合格后送生工生物工程(上海)有限公司測序。將所得序列通過 Blast程序和 GenBank、EzTaxon server［8］中核酸數(shù)據(jù)進行比對，采用Clustal X(Version1.8)進行多序列匹配排列，通過MEGA 4.1軟件包中的Kimura 2-parameter方法計算進化距離，用Neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹［9］;④DNA(G+C)mol%與DNA-DNA雜交率的測定:采用試劑盒法提取菌株基因組DNA。經(jīng)高氯酸水解后，采用反相高效液相色譜法［10］測定(G+C)mol%。采用微孔板法進行DNA雜交［11］，堿性磷酸酶標(biāo)記鏈親和素法測定雜交率［12］，測定3次取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅樹林放線菌的分離

對于自然風(fēng)干的樣品，在分離培養(yǎng)基上3～5 d后開始生長放線菌，同時也出現(xiàn)少量細(xì)菌菌落。對于55℃處理6 min的樣品，細(xì)菌數(shù)量減少，放線菌種類和數(shù)量最多;對于120℃干熱處理1 h的樣品，培養(yǎng)基上沒有細(xì)菌生長，鏈霉菌的數(shù)目也較少，稀有放線菌的數(shù)量明顯增多，其中腐植酸-維生素培養(yǎng)基上生長出來的稀有放線菌最多。本實驗從紅樹林土壤中共分離到206株放線菌，根據(jù)菌落形態(tài)及代表菌株的測序結(jié)果，大致分布在7個屬，其中鏈霉菌屬(Streptomyces)的數(shù)量最多，占總量的63.1%(130株);稀有放線菌占總量的36.9%(76株)，其中小單孢菌屬(Micromonospora)占18.4%(38 株)，糖多孢菌屬(Saccharopolyspora)占7.8%(16株)，假諾卡氏菌屬(Pseudonocardia)、束村氏菌屬(Tsukamurella)、擬諾卡氏菌屬(Nocardiopsis)分別占2.9%(6株)，白蟻菌屬(Isoptericola)占1.9%(4株)。分離結(jié)果與文獻報道的鏈霉菌與小單孢菌是海岸濕地的主要放線菌類群結(jié)論一致［10］。

2.2 根結(jié)線蟲拮抗放線菌的篩選

從206株放線菌中，初篩獲得抗松材線蟲校正死亡率50%以上的菌株28株，占供試菌株的13.6%;復(fù)篩時，當(dāng)發(fā)酵液稀釋40倍、處理時間24 h，獲得抗根結(jié)線蟲校正死亡率40%以上的菌株3株，其中菌株HA11166校正死亡率為51.6%。對該菌株連續(xù)繼代培養(yǎng)5次，其抗蟲活性穩(wěn)定，表明其產(chǎn)生抗線蟲活性物質(zhì)的遺傳性能是穩(wěn)定的。

2.3 活性菌株HA11166的鑒定

2.3.1 形態(tài)和培養(yǎng)特征 菌株HA11166在試驗用的6種固體培養(yǎng)基上均生長良好，形成豐富的基內(nèi)菌絲和氣生菌絲?；z淺黃色至黃褐色，無可溶性色素產(chǎn)生。氣絲白色至乳白色，分枝少，長、直或不規(guī)則彎曲，有橫隔，Z字形折曲。孢子橢圓形至長柱形，表面光滑(圖1)。

2.3.2 生理生化鑒定 菌株HA11166能利用D-葡萄糖、D-果糖、L-鼠李糖、L-脯氨酸、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-甘露糖、纖維二糖、D-半乳糖、甘氨酸、麥芽糖、山梨醇、甘露醇，不能利用蔗糖、D-棉子糖、丙三醇、山梨酸、3，5-二硝基水楊酸、乙酰水楊酸、肌醇。硝酸鹽還原，淀粉水解，纖維素不水解，明膠不液化，牛奶不凝固不胨化，不產(chǎn)生黑色素和H2S。pH生長范圍為 6.0～12(最適 pH 7.0)，溫度生長范圍為4～43℃(最適37℃)，鹽度生長范圍為0% ～5%(最適1%)。對氯霉素、紅霉素、卡那霉素、利福霉素、四環(huán)素、新生霉素、新霉素和氨芐青霉素敏感，對萘啶酸、慶大霉素不敏感。主要脂肪酸為 iso-C14:0(9.6%)、ant-C15:0(32.8%)、iso-C16:0(19.2%)、C16:0(8.3%)和C16:1ω9c(8.5%)。主要磷酸類脂為磷脂酰乙醇胺(phosphatidyl ethanolamine，PE)、磷脂酰肌醇甘油糖苷(phosphatidylinositol mannosides，PIM)、磷脂酰膽堿(phosphatidyl choline，PC)和一種未知糖脂(unknown glycolipid，GL)。

圖1 菌株HA11166菌絲與孢子掃描電鏡照片(5600×)Fig.1 Scanning electron micrograph of strain HA11166(5600×)

2.3.3 16S rDNA序列測定及系統(tǒng)發(fā)育分析 經(jīng)測序獲得菌株HA11166的16S rDNA近全長序列1385 bp，所得序列經(jīng)校對后提交GenBank，登錄號為JQ799045。采用Blast和EzTaxon軟件比對，同源性高的均為Nocardiopsis(擬諾卡氏屬)，同源性最高的模式菌株為海藻糖擬諾卡氏菌Nocardiopsis trehalosi VKM Ac-942T(98.3%)，其次為堆肥擬諾卡氏菌Nocardiopsis composta KS9T(97.6%)、蒼黃擬諾卡氏菌Nocardiopsis gilva YIM 90087T(97.5%)。根據(jù)序列同源性從高到低的順序選取8株模式菌株，利用 ClustalX(1.8)和 Mega 4.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)，菌株HA11166與Nocardiopsis trehalosi VKM Ac-942T處于同一分支，親緣關(guān)系最近。

2.3.4 (G+C)mol%與DNA-DNA雜交率測定結(jié)果 經(jīng)測定，菌株HA11166的(G+C)mol%為73.7%。菌株 HA11166與 Nocardiopsis trehalosi VKM Ac-942T的DNA-DNA雜交率為38.8%。

圖2 基于16S rDNA的菌株HA11166與相關(guān)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain HA11166 and related strains based on 16S rDNA

3 討論

根結(jié)線蟲病的生物防治資源包括天敵真菌、細(xì)菌、放線菌及其代謝產(chǎn)物和植物等。自20世紀(jì)70年代中期，根結(jié)線蟲的生物防治便開始受到全世界的關(guān)注，其中研究較多的是食線蟲真菌(Nematophagous fungi)、專性寄生細(xì)菌(Obligate endoparasitic bacteria)、根際細(xì)菌(Rhizobacteria)和放線菌(Actinomycetes)。作為抗生素的主要來源，放線菌在線蟲生防研究中，主要是基于殺蟲活性物質(zhì)來實現(xiàn)的。如:由放線菌產(chǎn)生的莫比霉素(Milbemycin)、南昌霉素(Nanchangmycin)，成為安全高效低毒殺蟲劑首選材料的阿維菌素(Avermectin)也是從除蟲鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)的［13］。田陽等［14］發(fā)現(xiàn)海洋放線菌 M1D14 發(fā)酵產(chǎn)物對3種線蟲具有抑制作用，尤其對南方根結(jié)線蟲(Meloidogyne incognita)毒力最強，具有很好的應(yīng)用前景。國外在該方面的研究不多，Saroj等［15］曾報道篩選到15株放線菌對自由生活線蟲Panagrellus redivivus具有殺線蟲活性。本課題組近年來從海洋放線菌中篩選到多株放線菌對根結(jié)線蟲具有拮抗作用，包括鏈霉菌、小單孢菌(Micromonospora)、糖多孢菌(Saccharopolyspora)、假諾卡氏菌(Pseudonocardia)、擬諾卡氏菌等屬，本文對擬諾卡氏菌株HA11166進行了首次報道。

對于放線菌的分類鑒定，一般認(rèn)為2菌株16S rDNA序列同源性小于97%為不同的種，但同源性大于97%時也不一定是同一個種。DNA-DNA雜交被確定為建立新種的必要標(biāo)準(zhǔn)之一，用于種水平上的分類學(xué)研究。1987年，國際系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)委員會(ICSB)規(guī)定，DNA同源性≥70%或雜交分子的熱解鏈溫度差≤2℃為細(xì)菌種的界限。在本實驗中，菌株HA11166與Nocardiopsis trehalosi VKM Ac-942T的16S rDNA相似性為98.3%，在發(fā)育樹上處于同一分支，親緣關(guān)系最近。2菌株DNA-DNA雜交率僅為38.8%，小于細(xì)菌定種的界限70%。在形態(tài)與生理生化特征方面二者也存在一定差異(表1)。因此，基于16S rDNA序列相似性、系統(tǒng)發(fā)育分析、分子水平鑒定以及生理生化特性結(jié)果，將菌株HA11166T鑒定為擬諾卡氏菌屬的一個新種，建議命名為東寨港擬諾卡氏菌(Nocardiopsis dongzhaigangensis sp.nov.)，HA11166T為模式菌。

表1 菌株HA11166與N.trehalosi VKM Ac-942T特征差異比較Table 1 Differential characteristics of strain HA11166 and N.trehalosi VKM Ac-942T

模式菌株HA11166T(Nocardiopsis dongzhaigangensis sp.nov.)的特征描述:細(xì)胞革蘭陽性、好氧，氣絲白色至乳白色，分枝少，長、直或不規(guī)則彎曲，有橫隔，Z字形折曲。孢子橢圓形至長柱形，表面光滑?；z淺黃色至黃褐色，無可溶性色素產(chǎn)生。pH生長范圍6.0～12.0，最適 pH 7.0。溫度生長范圍4～43℃，最適37℃。NaCl耐受范圍0% ～5%，最適1%。能利用 D-葡萄糖、D-果糖、L-鼠李糖、L-脯氨酸、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-甘露糖、纖維二糖、D-半乳糖、甘氨酸、麥芽糖、山梨醇、甘露醇，不能利用蔗糖、D-棉子糖、丙三醇、山梨酸、3，5-二硝基水楊酸、乙酰水楊酸、肌醇。硝酸鹽還原，淀粉水解，纖維素不水解，明膠不液化，牛奶不凝固不胨化，不產(chǎn)生黑色素和H2S。對氯霉素、紅霉素、卡那霉素、利福霉素、四環(huán)素、新生霉素、新霉素和氨芐青霉素敏感，對萘啶酸、慶大霉素不敏感。主要脂肪酸 為 iso-C14:0、ant-C15:0、iso-C16:0、C16:0和 C16:1ω9c。主要磷酸類脂為PE、PIM、PC和未知糖脂GL。(G+C)mol%為73.7%。模式種HA11166T分離于海南省東寨港紅樹林底泥。

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