張 衛(wèi)，畢春霞，羅 瑋，秦江楠，陳 豪，王 斌，閆志勇*

(1.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物教研室，山東 青島 266071;2.青島市立醫(yī)院 檢驗(yàn)科，山東 青島 266071)

嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas mahophilia)是一種革蘭陰性非發(fā)酵菌，廣泛存在于自然界及人和動(dòng)物體內(nèi)，是目前引起院內(nèi)感染的常見(jiàn)病原菌之一。近年來(lái)由該菌引起的感染迅速增加，而且對(duì)抗菌藥物呈現(xiàn)多重耐藥而引起人們廣泛關(guān)注［1］。隨著細(xì)菌蛋白質(zhì)工程研究的不斷深入，人們不僅關(guān)注細(xì)菌蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、理化特性、生物功能，更關(guān)注其分泌過(guò)程，嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌的許多生物學(xué)活性、致病性、耐藥性等與其分泌各種蛋白質(zhì)密切相關(guān)。作為革蘭陰性細(xì)菌蛋白分泌主要途徑，T2SS(TypeⅡSecretion System，T2SS)一般由分泌途徑轉(zhuǎn)膜蛋白基因簇為中心［2］，主要涉及12～16種蛋白，且數(shù)量具有種屬特異性。T2SS在細(xì)菌的生理活動(dòng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，它不僅存在于各種病原菌中，而且是攻擊宿主細(xì)胞和組織的各類消化酶外排必經(jīng)之路，有研究表明病原菌T2SS缺失株的毒力明顯減低［3］，可見(jiàn)，研究細(xì)菌的分泌系統(tǒng)具有重要的意義。本實(shí)驗(yàn)室從海洋雙齒圍沙蠶消化道分離得到1株嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌D2株，研究發(fā)現(xiàn)該菌能分泌大量的 SMP蛋白(GenBank 收錄號(hào) GQ413951)［4］，據(jù)繪制出的 SMP基因結(jié)構(gòu)草圖分析顯示，該基因與Ⅱ型分泌系統(tǒng)轉(zhuǎn)膜蛋白基因簇(Gsp，general secretory pathway transmembrane protein)緊密串聯(lián)，同時(shí)根據(jù)該基因的功能、氨基酸序列、信號(hào)肽(N'端24個(gè)氨基酸具有顯著的Sec信號(hào)肽特征)等特征推測(cè)，該蛋白是依賴T2SS來(lái)實(shí)現(xiàn)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的［5］。據(jù)此采用基因移步法，成功測(cè)定出了嗜麥芽寡氧單胞菌的2套T2SS，為進(jìn)一步研究該菌T2SS的功能及蛋白分泌機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌D2株是從海洋生物雙齒圍沙蠶消化道中分離獲得菌株(中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心收藏號(hào)為 CGMCC 1868)［4］;pMD18-T載體購(gòu)自大連寶生物工程有限公司;大腸埃希菌JM109為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑 細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)自Promega公司;Prime-STAR HS polymerase、DNA Marker、dNTPs 等購(gòu)自TaKaRa公司;質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自O(shè)mega公司;X-gal、氨芐青霉素、IPTG等均購(gòu)自Sigma公司。

1.1.3 主要儀器 梯度基因擴(kuò)增儀購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司;UVP凝膠成像分析系統(tǒng)購(gòu)自法國(guó)VILBER LOURMAT公司;RW-0525G低溫水循環(huán)儀購(gòu)自美國(guó)西蒙公司。

1.2 方法

1.2.1 PCR引物的設(shè)計(jì) 從GenBank細(xì)菌基因組計(jì)劃數(shù)據(jù)庫(kù)中下載嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌K279a(NC_01094)、JV3(NC_015947)、D457(NC_017671)、R551-3(NC_011071)株的2套T2SS相關(guān)基因序列(為表述方便，分別命名為 T2SS1、T2SS2)，利用DNASTAR軟件對(duì)比分析其序列的同源性，使用Primer Priemer 5.0設(shè)計(jì)引物，引物見(jiàn)表1。

表1 嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌D2株Ⅱ型分泌系統(tǒng)Gsp基因簇?cái)U(kuò)增引物Table 1 The PCR primers to the Gsp of typeⅡ secretory system in S.maltophilia D2

續(xù)表

1.2.2 細(xì)菌基因組DNA的提取 挑取D2株單個(gè)菌落接種LB液體培養(yǎng)基中，25℃震蕩培養(yǎng)18 h，使用Promega基因組DNA提取試劑盒參照說(shuō)明書提取。

1.2.3 PCR 擴(kuò)增 采用 TaKaRa的 DNASTAR polymerase。50 μL反應(yīng)體系中DNA模板(10 ng)3 μL，2 × PCR buffer 25 μL，dNTP mix 4 μL，Taq酶 0.5 μL，上下游引物各 1.5 μL。循環(huán)體系為95 ℃ 5 min，98 ℃ 10 s，60 ℃ 5 s，72 ℃ 90 s，30個(gè)循環(huán)之后延伸10 min。

1.2.4 PCR產(chǎn)物序列測(cè)定 PCR產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠在紫外燈下切取目的片段，用凝膠回收試劑盒純化。將純化后的PCR產(chǎn)物在16℃低溫循環(huán)儀中與pMD18-T Vector連接過(guò)夜，其10 μL連接體系為 buffer 5.0 μL，水 1.0 μL，載體 1.0 μL，PCR產(chǎn)物3.0 μL。次日轉(zhuǎn)入用 CaCl2法制備的JM109感受態(tài)細(xì)胞中，并接種到含有IPTG(200 mg/mL)和 X-Gal(20 mg/mL)、Amp(100 mg/mL)的LB平板上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，在平板上挑選白色菌落接種于含有氨芐青霉素LB液體培養(yǎng)基內(nèi)，37℃震蕩培養(yǎng)12～18 h后，按Omega質(zhì)粒提取試劑盒說(shuō)明書提取。將所提取的質(zhì)粒用EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定，陽(yáng)性克隆送上海生工測(cè)序。

1.2.5 測(cè)序結(jié)果拼接及同源性分析 將先后獲得的16個(gè)基因測(cè)序片段采用DNASTAR軟件拼接并尋找開(kāi)放讀碼框(Open Reading Frame，ORF)，將獲取的ORF以及ORF編碼的氨基酸采用DNASTAR軟件對(duì)比分析各自同源性。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR產(chǎn)物純化及陽(yáng)性克隆的酶切鑒定

以嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌D2株的基因組為模板，共獲得16個(gè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，其中T2SS1基因簇?cái)U(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度依次為 1191、1658、1464、1393、1636、1602、1104 bp;T2SS2 基因簇?cái)U(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度依次為 1692、1339、1417、1705、1500、1380、1658、1670、968 bp，如圖 1 所示。

圖1 D2株T2SS基因片段的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR products of T2SS

2.2 GSP基因簇序列分析及基因結(jié)構(gòu)草圖的繪制

將獲得的16個(gè)片段先后測(cè)序后進(jìn)行拼接，經(jīng)DNASTAR等軟件進(jìn)行分析顯示，所獲得的序列里共包含有22個(gè)完整的開(kāi)放讀碼框架(ORF)，在GenBank中進(jìn)行Blast比對(duì)證實(shí)分別為T2SS1或T2SS2的組成基因，并獲得GenBank收錄號(hào)，其中T2SS1的11個(gè)ORF分別為GspF(GU377212)、E(HM151387)、D(JQ070336)、M(JQ070343)、L(JQ070342)、K(JQ070341)、G(JQ070335)、J(JQ070338)、L(JQ070339)、H(JQ070340)、C(JQ070337);T2SS2的的11個(gè)ORF分別為GspE(KF234409)、F(KF234410)、G(KF234411)、H(KF234412)、I(KF2344113)、J(KF234414)、K(KF234415)、L(KF234416)、M(KF234417)、N(KF234418)、D(KF234419)。采用生物信息學(xué)技術(shù)分析后發(fā)現(xiàn)，T2SS1基因簇中有D2蛋白酶基因和一個(gè)未知基因序列的插入;T2SS2串聯(lián)成簇，共10656 bp，中間無(wú)其他基因插入。嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌D2株2套T2SS的基因結(jié)構(gòu)草圖如圖2所示(圖2A、B)。

圖2 嗜麥芽寡氧單胞菌D2株T2SS1、T2SS2基因簇結(jié)構(gòu)草圖Fig.2 The draft of T2SS1 and T2SS2 gene clusters of S.maltophilia D2

2.3 Gsp基因的同源性比較

將T2SS1和T2SS2的基因簇序列使用wibur-Lipman法，蛋白序列使用Lipman-pearson法做對(duì)比，發(fā)現(xiàn)2套T2SS的E基因同源性相比其他基因簇的同源性要高，其基因和氨基酸同源性均在50%以上，其他基因簇序列在20% ～50%之間不等。具體對(duì)比結(jié)果如表2所示。

表2 D2株2套T2SS基因簇的相應(yīng)基因的對(duì)比分析Table 2 The Comparison and analysis the corresponding 2 T2SSs gene clusters in D2

將上述22個(gè)完整的ORF在Pubmed上運(yùn)用Blast分析發(fā)現(xiàn)，T2SS1的基因簇序列與K279a的對(duì)應(yīng)蛋白基因序列同源性較高，最高為97%，與R551-3的相應(yīng)蛋白基因序列同源性均能達(dá)到80%以上，最高為99%。T2SS2的氨基酸序列與K279a及R551-3同源性均能達(dá)到85%以上，具體見(jiàn)表3和表4。

通過(guò)上述比較發(fā)現(xiàn)，嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌D2株各基因簇序列均與同種屬細(xì)菌的同種屬對(duì)應(yīng)基因簇親緣關(guān)系最近，而與假單胞菌屬同種蛋白親緣關(guān)系相對(duì)較近，與其他種屬同種蛋白的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

表3 D2株與其他菌株的T2SS1基因簇及其氨基酸同源性分析Table 3 The homology analysis of gene clusters and its amino acid of T2SS1 between D2 strain and other strains

續(xù)表

表4 D2株與其他菌株T2SS2基因簇及其氨基酸同源性分析Table 4 The homology analysis of gene clusters and its amino acid of T2SS2 between D2 strain and other strains

3 討論

本研究室2004年從海洋生物雙齒圍沙蠶消化道內(nèi)分離得到1株嗜麥芽寡氧單胞菌D2株，能大量胞外分泌SMP蛋白。前期研究發(fā)現(xiàn)SMP蛋白完整編碼序列前有一個(gè)跨膜的Sec信號(hào)肽，且與T2SS的Gsp基因簇串聯(lián)在一起，據(jù)此推測(cè)D2株SMP蛋白高效胞外分泌機(jī)制可能與T2SS密切相關(guān)。在所有蛋白分泌系統(tǒng)中，T2SS與細(xì)菌的致病性和耐藥性關(guān)系密切，該系統(tǒng)是在1993年產(chǎn)酸克雷伯菌分泌支鏈淀粉酶時(shí)被發(fā)現(xiàn)，后來(lái)發(fā)現(xiàn)它是革蘭陰性菌的常規(guī)分泌途徑［6］。以前認(rèn)為細(xì)菌體內(nèi)只有 1套 T2SS，然而自 2002年Geneviève Ball發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌PAO1株有2套Ⅱ分泌系統(tǒng)［7］，隨后研究人員相繼發(fā)現(xiàn)菊歐桿菌、陰溝腸桿菌、惡臭假單胞菌、青枯菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、產(chǎn)腸毒素大腸埃希菌(ETEC)的某些株中也具有2套Ⅱ型分泌系統(tǒng)［8］。

本研究發(fā)現(xiàn)，嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌D2株也存在2套T2SS(分別命名為T2SS1和T2SS2)，進(jìn)一步對(duì)測(cè)定出的2套T2SS序列運(yùn)用生物信息學(xué)軟件對(duì)比分析顯示，T2SS1和T2SS2各有11個(gè)GSP蛋白的開(kāi)放讀碼框。通過(guò)繪制基因結(jié)構(gòu)草圖顯示，雖然D2株的2套GSP基因簇的基因種類和數(shù)量相同，但是各基因在基因簇中的排列順序不同;此外，T2SS1的基因簇中插入了SMP基因和一段未知基因的序列，相對(duì)于基因簇緊密串聯(lián)的T2SS2來(lái)說(shuō)是一個(gè)顯著差別。對(duì)比發(fā)現(xiàn)2套分泌系統(tǒng)之間有一定的同源性，GspE的基因序列同源性為68%，氨基酸同源性為51%，其次為GspJ的氨基酸同源性為38%，其他基因簇氨基酸同源性為15%～38%，該結(jié)果與銅綠假單胞菌XcpT和HxcT的同源性具有一定的相似性［9］，提示2套T2SS的功能不完全相同。

T2SS1的基因簇?cái)?shù)目一般為12～16個(gè)，但是D2株卻只有11個(gè)基因簇，與野生黃桿菌屬Gsp基因簇比較，該菌株缺乏XpsO蛋白(在其他種屬中稱為GspA)。Ⅱ型分泌系統(tǒng)中，GspA與GspG、GspH、GspI、GspJ及GspK蛋白發(fā)揮同樣的功能，共同參與菌毛蛋白的組裝，有些種屬中沒(méi)有編碼GspA的基因［10］。D2株的T2SS2基因簇?cái)?shù)目變異較大，與同種屬的K279A、R551-3相比，數(shù)量上一樣，卻比銅綠假單胞菌PAO1株多了6個(gè)基因，分別是 GspE、F、L、M、N、D，比小腸結(jié)腸炎耶爾森多了GspH、M、N卻少了GspC。比較分析各基因簇的基因及相應(yīng)氨基酸序列發(fā)現(xiàn)，T2SS的基因簇有明顯的種屬特異性，D2株各Gsp基因序列與K279a及R551-3 Gsp相應(yīng)基因序列的同源性均在82%以上，而氨基酸序列同源性均在97%以上，有的甚至完全相同。與T1SS相比，T2SS2的Gsp基因序列和K279a及R551-3的基因序列同源性稍低，基因序列同源性最高為98%，氨基酸序列最低為85%。2套T2SS與銅綠假單胞菌相比其同源性均有所下降，且T2SS2比T2SS1下降更為明顯，與不同科的小腸結(jié)腸炎耶爾森菌和霍亂弧菌相比其同源性均較低。

本研究獲得了嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌T2SS的基因序列，從而為進(jìn)一步研究該菌的蛋白的分泌機(jī)制奠定基礎(chǔ)，也為從基因和蛋白水平上在嗜麥芽寡氧單胞菌的生理、功能、致病性、耐藥機(jī)制、活性物質(zhì)的開(kāi)發(fā)、生物工程改造和利用等領(lǐng)域的深入研究提供更多參考。

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