楊 瑞，王 斌，錢冬萌，李 玲，周 雯，王桐梅，胡 明，陳 豪，宋旭霞

(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室，山東 青島 266071)

巨細(xì)胞病毒(cytomegalovirus，CMV)屬于β皰疹病毒亞科，為線性雙鏈DNA病毒，其基因組長(zhǎng)度超過(guò)230 kb［1］，能夠使人類致病的CMV為人巨細(xì)胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)。我國(guó)是世界上HCMV先天性感染發(fā)病較高的國(guó)家之一，在普通人群中的感染率為80%以上，某些特殊地區(qū)和人群中感染率可達(dá)100%。在孕婦和免疫能力低下者(如器官移植病人、艾滋病患者)，該病毒可引發(fā)極為嚴(yán)重的并發(fā)癥［2］。HCMV也能夠通過(guò)母嬰傳播，是人類重要的致畸、致神經(jīng)損傷病原體［3］。HCMV對(duì)宿主和組織培養(yǎng)均具有嚴(yán)格的種屬特異性，且機(jī)制尚不清楚。一般僅感染其自身宿主或同屬動(dòng)物，也只有用其自身宿主的成纖維細(xì)胞才可進(jìn)行體外培養(yǎng)，并產(chǎn)生高滴度的感染性子代病毒顆粒。雖然目前已有利用人源化小鼠成功建立HCMV感染與疾病的動(dòng)物模型［4-5］，但其昂貴的費(fèi)用等卻為科研帶來(lái)太多困難。HCMV感染容許細(xì)胞可分為吸附與穿入、病毒基因的表達(dá)、病毒DNA的復(fù)制以及病毒的組裝與釋放。HCMV感染宿主細(xì)胞后，其基因表達(dá)和調(diào)控呈現(xiàn)嚴(yán)格的時(shí)序性，依次表達(dá)即刻早期基因(immediate-early，IE)、早期基因 e(early，E)和晚期(late，L)基因。Sandford等［6］發(fā)現(xiàn)即使把 HCMV IE基因的增強(qiáng)子換成MCMV的增強(qiáng)子也并不能改變其宿主趨向性，由此證明HCMV的宿主特異性并不取決于即刻早期階段。本研究用人和小鼠新鮮胚胎組織分離培養(yǎng)原代成纖維細(xì)胞，觀察2種細(xì)胞體外感染HCMV AD169后的形態(tài)學(xué)改變，檢測(cè)各期病毒基因和蛋白表達(dá)情況等，為進(jìn)一步研究和探討HCMV可能的種屬特異性機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料主要試劑與儀器

胎齡為8～10周的自愿米菲司酮流產(chǎn)的新鮮胎兒，經(jīng)其父母知情同意，由青島市海慈醫(yī)院提供;6～8周昆明小鼠購(gòu)自青島市藥品檢驗(yàn)所;DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清為Hyclone公司產(chǎn)品;RNAiso Plus購(gòu)自TaKaRa公司;AMV Reverse Transcription System Kit、PCR Mix 購(gòu)自 Fermentas公司;Triton X-100購(gòu)自Sigma公司;RIPA細(xì)胞裂解液、PMSF購(gòu)自Solarbio公司;ECL發(fā)光顯色試劑盒購(gòu)自Boster公司;5×蛋白上樣緩沖液;彩色預(yù)染蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)(10～170 ku)購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所(Catalog No.P0068);封閉用正常山羊血清，鼠抗 IE1、IE2、UL84、UL83，Cy3 標(biāo)記的羊抗鼠IgG購(gòu)自北京博奧森生物公司;倒置熒光顯微鏡為日本Olympus公司產(chǎn)品;白光凝膠成像系統(tǒng)為法國(guó)Vilber Lourmat產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 原代細(xì)胞分離與培養(yǎng) 人胚胎用75%乙醇消毒10 min后，無(wú)菌器械解剖取肺，將其剪成直徑小于0.5 mm的碎塊，行組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)。將6～8周齡昆明小鼠雌雄比例為2∶1合籠，次日早晨檢查雌鼠，出現(xiàn)陰栓者記為0.5 d。選擇孕期12.5～14.5 d的雌鼠脫臼處死，75%酒精消毒后，用無(wú)菌器械取出小鼠胚胎，用PBS清洗3～5遍，去除頭部、四肢和內(nèi)臟，剩余軀干部分剪成小于0.5 mm的碎塊，行組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)。原代人胚胎成纖維細(xì)胞(HEF)和小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)在含有10%胎牛血清的DMEM/F12完全培養(yǎng)基中呈貼壁生長(zhǎng)，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待其長(zhǎng)滿瓶底90%以上常規(guī)消化、傳代，取3代以內(nèi)生長(zhǎng)良好、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 HCMV病毒增殖和滴度測(cè)定 取出凍存的HCMV AD169毒株(法國(guó)巴斯德研究所惠贈(zèng))，在流動(dòng)的自來(lái)水中迅速融化，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HEF更換無(wú)血清培養(yǎng)基，加入100 μL病毒懸液，于37℃、5%的恒溫箱中培養(yǎng)2 h，期間每隔15 min輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶1次。棄掉培養(yǎng)液后，加入含有2%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基維持培養(yǎng)，隨時(shí)觀察并記錄細(xì)胞的變化，待細(xì)胞病變至80%以上時(shí)用細(xì)胞刮刀刮取細(xì)胞并收集培養(yǎng)液上清，－86℃反復(fù)凍融3次，使病毒顆粒釋放，1500 r/min離心10 min，收集上清液作為病毒儲(chǔ)存液，分裝至EP管并保存于－86℃冰箱。通過(guò)空斑定量法，確定本實(shí)驗(yàn)所用病毒滴度為2×106PFU/mL。

1.2.3 HCMV特征性病變效應(yīng)(CPE)的觀察將3代以內(nèi)且對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HEF和MEF接種于25 m2培養(yǎng)瓶中(1×106個(gè)/mL)，常規(guī)培養(yǎng)24 h，換用無(wú)血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，加入制備好的HCMV AD169毒株100 μL(MOI=5)繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，棄去培養(yǎng)液，分別加入2%FBS的 DMEM/F12培養(yǎng)基維持培養(yǎng)，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照(未感染病毒的正常細(xì)胞)，在相差顯微鏡下逐日觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。另外，將HCMV感染MEF 3 d后的培養(yǎng)物上清反復(fù)凍融3次，離心后收取培養(yǎng)物上清，分別將 1 μL、10 μL、100 μL、1 mL、10 mL 的上清液加入生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HEF，換用無(wú)血清的DMEM/F12培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2 h后棄去培養(yǎng)液，分別加入2%FBS的 DMEM/F12培養(yǎng)基維持培養(yǎng)，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照(未感染病毒的正常細(xì)胞)，相差顯微鏡下逐日觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。

1.2.4 RT-PCR 檢測(cè) HCMV 感染2 種細(xì)胞6、24、48 h時(shí)IE1、IE2、UL84、UL83 mRNA的表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HEF和MEF接種細(xì)胞培養(yǎng)皿(密度約105/mL)，培養(yǎng)過(guò)夜后加入 HCMV AD169(MOI=5)，分別在病毒感染后6、24、48 h收集細(xì)胞。按照RNAiso Plus說(shuō)明書提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定其純度和濃度，并在DNase處理后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，PCR擴(kuò)增IE1、IE2、UL84、UL83基因，各基因的PCR引物序列見(jiàn)表1。PCR擴(kuò)增條件:94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s共30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物后UVP凝膠成像系統(tǒng)拍照。Quantity One軟件進(jìn)行灰度分析，將目的基因條帶與內(nèi)參人β-actin和鼠GADPH基因條帶的灰度值的比值來(lái)作為目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

表1 RT-PCR引物序列表Table 1 Sequence of primers used for RT-PCR

1.2.5 Western-blot檢測(cè)HCMV AD169 感染2 種細(xì)胞24、48、72 h 時(shí) IE1、IE2、UL84、PP65 蛋白的表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HEF和MEF接種細(xì)胞培養(yǎng)皿(密度約105/mL)，用RIPA細(xì)胞裂解液400 μL、PMSF 4 μL提取未經(jīng)病毒感染的細(xì)胞和HCMV AD169感染24、48、72 h的總蛋白，以BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒進(jìn)行蛋白定量，取等量樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳至分離膠底部后，電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫?fù)u床封閉2 h，TBST洗膜 3次，每次 10 min;鼠抗 IE1、IE2、UL84、PP65(UL83編碼產(chǎn)物)蛋白單克隆抗體 (1∶1000)4℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜3次后加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠和羊抗兔IgG，室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，Vilber Lourmat凝膠成像系統(tǒng)顯色。分析計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參Actin蛋白灰度之比，以此表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。所得數(shù)據(jù)以表示。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2.7 細(xì)胞爬片與免疫熒光 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HEF和MEF接種到含已包被玻片的24孔板內(nèi)(密度約105/mL)，培養(yǎng)24 h后換成2%DMEM/F12培養(yǎng)液，4 h后加入HCMV，培養(yǎng)72 h后多聚甲醛固定細(xì)胞，0.1%Triton X-100室溫透化30 min，10%山羊血清室溫封閉30 min，過(guò)夜孵育小鼠抗 HCMV IE、PP65、β-actin蛋白單克隆抗體，PBS充分洗滌后，與FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG和Cy3標(biāo)記的山羊抗兔IgG 37℃孵育2 h，hoechst室溫染核10 min，75%甘油封片后在激光共聚焦顯微鏡下觀察、拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 HCMV AD169感染HEF和MEF形態(tài)學(xué)觀察

原代培養(yǎng)24 h即可見(jiàn)HEF和MEF呈放射狀從組織塊中遷移出來(lái)，貼壁生長(zhǎng)。72 h即可棄去組織塊并進(jìn)行傳代培養(yǎng)。初次培養(yǎng)的細(xì)胞會(huì)夾雜一些非成纖維細(xì)胞，可利用差速貼壁法純化得到高純度的細(xì)胞系。細(xì)胞形態(tài)為典型纖維形或梭形，細(xì)胞輪廓清晰，折光度良好。

取3代以內(nèi)生長(zhǎng)良好、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HEF和MEF用于感染HCMV AD169(MOI=5)，此過(guò)程用含2%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基維持培養(yǎng)。3 d后HEF細(xì)胞出現(xiàn)HCMV特征性巢狀病變效應(yīng)(CPE)，巢內(nèi)細(xì)胞變大變圓，而周圍細(xì)胞仍為成纖維形;6 d左右，超過(guò)80%的HEF細(xì)胞出現(xiàn)典型的CPE，細(xì)胞變圓，部分細(xì)胞融合為多核巨細(xì)胞，呈典型的巨細(xì)胞病毒感染后的細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。而MEF感染組則未發(fā)生明顯的CPE，而是出現(xiàn)大規(guī)模的細(xì)胞死亡現(xiàn)象，細(xì)胞狀態(tài)愈來(lái)愈差，有老化現(xiàn)象(見(jiàn)圖1)。

另外，將HCMV AD169感染MEF 3 d后的培養(yǎng)物上清反復(fù)凍融3次，離心后取上清，設(shè)置濃度梯度再分別感染HEF，相差顯微鏡下逐日觀察均未出現(xiàn)明顯的HCMV特征性CPE。

圖1 HCMV AD169感染后HEF和MEF的形態(tài)學(xué)變化(MOI=5)(400×)Fig.1 The morphological changes of HEF and MEF which were infected with HCMVAD169(MOI=5)by phase contrast microscope(400 ×)

2.2 RT-PCR檢測(cè)HCMV AD169感染HEF和MEF 后 IE1、IE2、UL84、UL83基因的表達(dá)

HCMV AD169(MOI=5)感染 HEF 6、24、48 h，IE1、IE2、UL84、UL83 mRNA 表達(dá)明顯高于未感染組(P ﹤0.01);而MEF 在6、24、48 h 僅IE1、IE2表達(dá)顯著高于未感染組(如圖2)，且IE2在HEF組中的相對(duì)表達(dá)量顯著高于MEF組(P﹤0.05)。延長(zhǎng)感染時(shí)間再行檢測(cè)，也未見(jiàn)任何變化。HEF和 MEF組中 IE1、IE2、UL84、UL83 mRNA相對(duì)表達(dá)量見(jiàn)表2。

2.3 Western-blot檢測(cè) HCMV AD169 感染HEF和MEF后IE、E、L蛋白的表達(dá)

HEF感染HCMVAD169后24 h檢測(cè)到IE1蛋白表達(dá)，48 h表達(dá) IE2、UL84蛋白，72 h表達(dá)PP65(UL83編碼產(chǎn)物)蛋白(如圖3)，其相對(duì)表達(dá)量均顯著高于未感染組(P﹤0.01)。而MEF感染HCMV AD169后僅在24 h顯著表達(dá)IE1和IE2蛋白(P﹤0.01)，不表達(dá) UL84和 PP65蛋白。且IE1、IE2在HEF組中的相對(duì)表達(dá)量顯著高于 MEF組(P﹤ 0.05)。HEF和 MEF組中IE1、IE2、UL84和PP65蛋白相對(duì)表達(dá)量見(jiàn)表3。

圖2 PT-PCR檢測(cè)HEF和MEF組IE1、IE2、UL84、UL83 mRNA 的表達(dá)Fig.2 Expressions of IE1、IE2、UL84、UL83 mRNA in HEF and MEF cells infected with HCMV by RT-PCR

表2 HEF和MEF組中IE1、IE2、UL84和UL83 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較()Table 2 The relative value of IE1，IE2，UL84 and UL83 mRNA in HEF and MEF groups

表2 HEF和MEF組中IE1、IE2、UL84和UL83 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較()Table 2 The relative value of IE1，IE2，UL84 and UL83 mRNA in HEF and MEF groups

注:與HEF和MEF組的0 h比較*P﹤0.01，與HEF組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較▲P﹤0.05，下表同。

組別IE1 IE2 UL84 UL83 HEF 組0 h 0 0 0 06 h 0.87 ±0.07*0.71 ±0.11*0.77 ±0.28*1.38 ±0.37*24 h 0.92 ±0.22*1.11 ±0.09*0.94 ±0.49*1.87 ±0.09*48 h 0.98 ±0.18*1.29 ±0.32*1.05 ±0.43*2.01 ±0.61*MEF組0 h 0 0 0 06 h 0.57 ±0.12＊▲ 0.31 ±0.05＊▲ 0.09 ±0.02 0.05 ±0.0224 h 0.61 ±0.06＊▲ 0.29 ±0.03＊▲ 0.10 ±0.04 048 h 0.63 ±0.13＊▲0.37 ±0.02 ＊▲00

圖3 Western-blot檢測(cè)HEF和MEF 組 IE1、IE2、UL84和PP65蛋白的表達(dá)Fig.3 Expressions of IE1、IE2、UL84 and PP65 in HEF and MEF by Western-blot

表3 HEF和MEF組中IE1、IE2、UL84和PP65蛋白相對(duì)表達(dá)量比較()Table 3 The relative value of IE1、IE2、UL84 Group and PP65 in HEF and MEF groups

表3 HEF和MEF組中IE1、IE2、UL84和PP65蛋白相對(duì)表達(dá)量比較()Table 3 The relative value of IE1、IE2、UL84 Group and PP65 in HEF and MEF groups

組別IE1 IE2 UL84 PP65 HEF 組0 h 0 0 0 024 h 0.83 ±0.12*0.53 ±0.08* 0 048 h 0.79 ±0.06*0.57 ±0.17*0.83 ±0.09*0.51 ±0.19*72 h 0.67 ±0.03*0.61 ±0.07*0.95 ±0.17*0.59 ±0.24*MEF組0 h 0 0 0 024 h 0.33 ±0.23＊▲ 0.27 ±0.08＊▲ 0 048 h 0.41 ±0.09＊▲ 0.26 ±0.13＊▲ 0 072 h 0.38 ±0.17＊▲ 0.21 ±0.21＊▲00

圖4 免疫熒光檢測(cè)HEF和MEF感染HCMV AD16972 h后IE和PP65蛋白的表達(dá)Fig.4 Expressions of IE and PP65 protein in HEF and MEF by immunofluorescence assay

2.3 免疫熒光檢測(cè)HCMV AD169感染HEF和MEF后IE和PP65蛋白的表達(dá)

HCMV AD169(MOI=5)感染HEF 72 h明顯表達(dá)IE和PP65蛋白，而MEF內(nèi)未見(jiàn)明顯的IE和PP65蛋白(見(jiàn)圖4)。

3 討論

HCMV具有嚴(yán)格的種屬特異性和細(xì)胞嗜性，在人以外的動(dòng)物組織和細(xì)胞上難以建立復(fù)制并產(chǎn)生完整的子代病毒顆粒，長(zhǎng)期以來(lái)國(guó)內(nèi)外對(duì)CMV致病性的研究主要是以MCMV感染鼠為模型進(jìn)行研究。但是近年來(lái)，國(guó)內(nèi)學(xué)者相繼有文章報(bào)道成功建立HCMV感染野生型小鼠的動(dòng)物模型。本實(shí)驗(yàn)室選取長(zhǎng)期連續(xù)傳代擴(kuò)增的HCMV AD169毒株和從昆明小鼠胚胎成功分離培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞，將相同毒株以相同的MOI值(MOI=5)感染HEF(陽(yáng)性對(duì)照組)和MEF(實(shí)驗(yàn)組)，光學(xué)相差顯微鏡觀察細(xì)胞感染后的形態(tài)學(xué)變化，發(fā)現(xiàn)并未出現(xiàn)明顯的HCMV特征性CPE。另外，將HCMV感染MEF 72 h后的培養(yǎng)物上清反復(fù)凍融3次，離心后的上清設(shè)置濃度梯度分別感染HEF，亦未出現(xiàn)明顯的CPE，不符合柯赫法則對(duì)于微生物感染的要求。本實(shí)驗(yàn)為盡可能模擬真實(shí)的HCMV感染允納細(xì)胞和非允納細(xì)胞的體內(nèi)環(huán)境，用新鮮的人和小鼠胚胎組織中分離培養(yǎng)出原代HEF和MEF，以HCMV AD169株感染HEF為陽(yáng)性對(duì)照，RT-PCR結(jié)果顯示在感染病毒的MEF細(xì)胞內(nèi)，僅HCMV IE1和IE2即刻早期基因表達(dá)量顯著高于未感染HCMV組(P﹤0.01);Westernblot結(jié)果顯示只有IE1和IE2蛋白表達(dá)量顯著高于未感染組(P﹤0.01);免疫熒光檢測(cè)未發(fā)現(xiàn)明顯的IE和PP65蛋白的表達(dá)。以上結(jié)果均表明，本實(shí)驗(yàn)室儲(chǔ)存HCMV AD169株不能體外跨種屬感染原代培養(yǎng)的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞，未能成功建立HCMV AD169株體外感染小鼠成纖維細(xì)胞的動(dòng)物模型，且HCMV基因產(chǎn)物在原代MEF細(xì)胞中的表達(dá)阻止在IE蛋白表達(dá)與l基因表達(dá)之間。

作為人類皰疹病毒組中最大的病毒，HCMV感染宿主細(xì)胞后，其基因表達(dá)和調(diào)控呈現(xiàn)嚴(yán)格的時(shí)序性，依次表達(dá)即刻早期基因IE1和IE2，早期基因E和晚期基因L。其中IE基因主要編碼一些免疫調(diào)節(jié)因子，其表達(dá)是由宿主細(xì)胞因子所激活，并不依賴任何新的蛋白的合成［7］。IE蛋白為E基因的表達(dá)提供必要的條件［8］。雖然IE基因在宿主細(xì)胞中的存在有重要意義，但它的表達(dá)并不等同于完整病毒顆粒的復(fù)制。Ellsmore等［9］證實(shí)HCMV能夠有效吸附并穿入多種細(xì)胞包括一些非容許細(xì)胞系如人胚腎293細(xì)胞和Vero細(xì)胞，并在HCMV穿入細(xì)胞后檢測(cè)到了IE1的表達(dá)。Lafemina等［10］證實(shí) BALB/c-3T3 細(xì)胞可以表達(dá)HCMV或SCMV的IE1和IE2，但都不能產(chǎn)生完整病毒顆粒。UL84是一種HCMV早期蛋白，也是重要的功能蛋白，主要合成HCMV DNA復(fù)制因子，為HCMV DNA復(fù)制所必須。UL84是目前為止發(fā)現(xiàn)的唯一與IE2蛋白相互作用的病毒蛋白，Sanders RL等［11］研究發(fā)現(xiàn)IE2蛋白的相對(duì)表達(dá)量的降低能夠?qū)е?UL84蛋白丟失。PP65為UL83基因所編碼的 HCMV晚期蛋白之一，是HCMV的標(biāo)志性結(jié)構(gòu)蛋白。已有研究證實(shí)，在潛伏感染狀態(tài)下，IE基因持續(xù)、低水平的升高不能有效激活E、L基因，但在IE基因拷貝數(shù)明顯增多的細(xì)胞內(nèi)卻相繼發(fā)現(xiàn)高效表達(dá)的P52蛋白和MCP mRNA［12］。本研究結(jié)果顯示，雖然 HCMV 即刻早期基因和其蛋白產(chǎn)物可以在MEF內(nèi)持續(xù)表達(dá)，但表達(dá)水平顯著低于 HEF感染組(P﹤0.05)，相反在IE基因明顯高表達(dá)的允許細(xì)胞HEF內(nèi)也相繼高表達(dá)UL84和UL83基因和相應(yīng)的蛋白。此結(jié)果提示在HCMV跨種屬感染過(guò)程中，可能有一種機(jī)制從一開(kāi)始就在某種程度上阻止了病毒基因的表達(dá)和蛋白的翻譯，導(dǎo)致即刻早期基因和蛋白的表達(dá)減少。而少量的即刻早期蛋白又不足以啟動(dòng)早期和晚期基因的表達(dá)程序，故導(dǎo)致早期蛋白不能表達(dá)，進(jìn)而病毒DNA復(fù)制階段受阻，最終無(wú)法合成完整的子代病毒顆粒。因此認(rèn)為感染細(xì)胞MEF內(nèi)低水平的IE相對(duì)表達(dá)量可能是無(wú)法啟動(dòng)基因組表達(dá)的主要原因，也是HCMV種屬特異性分子機(jī)制形成的原因之一。

綜上所述，不完整的HCMV基因時(shí)序表達(dá)是HCMV種屬特異性形成的基礎(chǔ)，IE基因的低水平表達(dá)導(dǎo)致下游基因的表達(dá)無(wú)法正常啟動(dòng)可能是其中的關(guān)鍵因素。因此，尋找抑制IE基因表達(dá)的主要原因，是克服HCMV種屬特異性，建立HCMV感染的動(dòng)物模型的捷徑之一。

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