徐 妍，徐水凌

(1.遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)，廣東珠海 519041;2.嘉興學(xué)院醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室，浙江 嘉興314001)

創(chuàng)傷弧菌(Vibrio vulnificus，Vv)為存在于牡蠣、蝦、蚌等甲殼類海產(chǎn)品中的嗜鹽革蘭陰性弧菌，可引起傷口感染、胃腸炎、肌膜炎、原發(fā)性敗血癥等［1－3］，具有繁殖速度快、致病力強(qiáng)、致死率高等特點。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，創(chuàng)傷弧菌在感染小鼠樹突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)細(xì)胞時，可誘導(dǎo)DC發(fā)生凋亡，但其特殊的致病機(jī)制尚末十分清楚［4］。JAK/STAT通路具有調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和凋亡等多種生理功能，其中的STAT3在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起著重要作用［5－6］。創(chuàng)傷弧菌誘導(dǎo)DC凋亡時，STAT3信號分子的作用值得研究。本研究通過建立創(chuàng)傷弧菌(Vv 1.1758株)侵入小鼠樹突狀細(xì)胞(DC 2.4)的細(xì)胞模型，檢測不同感染時段DC 2.4細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率和STAT3表達(dá)情況，旨在進(jìn)一步明確創(chuàng)傷弧菌侵入小鼠樹突狀細(xì)胞時STAT3信號分子的作用，為深入研究創(chuàng)傷弧菌的致病機(jī)制提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)菌株和細(xì)胞株主要試劑 創(chuàng)傷弧菌(V.vulnificus 1.1758)標(biāo)準(zhǔn)菌株購于中國科學(xué)院微生物研究所;小鼠樹突狀細(xì)胞DC2.4細(xì)胞株由浙江大學(xué)免疫研究所惠贈，以10%胎牛血清(FBS)、100U/mol青霉素和鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液在37℃、5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)。

1.2 主要試劑 RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液購自美國Gibco公司;胎牛血清(Fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自杭州四季青生物制品有限公司;STAT3引物、GAPDH引物(由上海賽百盛基因技術(shù)公司合成);dNTP、RNase Inhibitor、DNA－marker(大連寶生物有限公司);TRIzol逆轉(zhuǎn)錄酶等購自美國sigma公司;Stat3(124H6)鼠單克隆抗體、p－Stat3(Ser727)單克隆抗體購自美國Cell signaling technology公司，異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的兔抗鼠IgG購自美國Sigma公司。

1.3 主要儀器 CKX31型倒置顯微鏡、流式細(xì)胞儀(COULTER－EPICS－XL，美國);BX51型熒光顯微鏡(OLYMPUS CKX41型，日本);Forma－311型CO2培養(yǎng)箱(Thermo，美國);680型全自動酶標(biāo)儀、凝膠成像分析儀(BIO－RAD，美國);DYY－8C型電泳儀(北京六一儀器廠)。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)和V.vulnificus1.1758懸液制備小鼠DC2.4株用10%胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)液(含100U/mL青霉素和鏈霉素)，37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3天傳代1次。V.vulnificus1.1758在哥倫亞血瓊脂培養(yǎng)基，經(jīng)37℃復(fù)蘇24 h，無菌狀態(tài)下挑取生長良好的V.vulnificus菌落，置pH7.4濃度0.01 mmol/L的 PBS混勻，3 000 r/min離心10 min，洗3次，將其重懸于不含抗生素的RPMI1640培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)，調(diào)整其細(xì)菌濃度為2.5×107CFU/mL，備用。

1.5 V.vulnificus 1.1758 與 DC2.4 細(xì)胞混合培養(yǎng) 取12孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔置一蓋玻片(0.8 cm ×0.8 cm)，分別接種 DC2.4 細(xì)胞(5.6 ×105個/mol)各1 mL，于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱孵育24 h。吸棄培養(yǎng)液，每孔加入2 mL 10%胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)液(不含抗生素)，分別孵育2 h。小心吸棄培養(yǎng)液，按細(xì)菌∶細(xì)胞(MOI)約為80∶1的比例，每孔加入V.vulnificus1.1758懸液1 mL(濃度為2.5 ×107CFU/mL)，37 ℃分別孵育 0 h，1 h，2 h，4 h，6 h和8 h，用PBS沖洗3次，取出蓋玻片，以―20℃預(yù)冷的細(xì)胞固定液固定3 min，PBS洗2次，Giemsa染色、封片，光學(xué)顯微鏡下觀察，以10%FBS RPMI1640為陰性對照，各時間段重復(fù)4個復(fù)孔。同時，于混合培養(yǎng)的0 h，1 h，2 h，4 h，6 h 和 8 h，去除細(xì)胞培養(yǎng)板上的細(xì)胞培養(yǎng)液，每孔加入250 uL 0.1%Triton X－100于37℃ 裂解細(xì)胞，待細(xì)胞全部裂解后每孔加入RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液(含10%胎牛血清，無抗生素)500 μL終止裂解，混勻后每孔分別做1∶10和1∶100稀釋并接種于哥倫亞血瓊脂培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)18 h，計數(shù)各時間點創(chuàng)傷弧菌菌落總數(shù)(CFU)，同時計算不同培養(yǎng)時間的細(xì)菌侵入率。細(xì)菌侵入率(%)=不同培養(yǎng)時間的創(chuàng)傷弧菌菌落總數(shù) /培養(yǎng)前創(chuàng)傷弧菌菌落總數(shù) ×100%。

1.6 FACS檢測細(xì)胞凋亡率 收集混合培養(yǎng)0 h，4 h，6 h和8 h的 DC2.4細(xì)胞，PBS洗3次，分別用Annexin V FITC和Propidium iodide(PI)染色，嚴(yán)格按Annexin V－FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒操作說明書，采用流式細(xì)胞儀檢測各時間段的細(xì)胞凋亡率。

1.7 RT－PCR法檢測STAT3 mRAN的表達(dá) 以GAPDH為內(nèi)參基因:上游引物:5’－CAAGGTCATCCATGACAACTTTG－3’，下游引物:5’－GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG －3’，目的基因片段長度554bp;STAT3引物序列:上游引物5’－GGGCTGAGAGCAGAAGGGAGCA－3’，下游引物5’－ GCCTGAAGACAGCGCTGGAGAG －3’，目的基因片段長度為337 bp。

1.7.1 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA 按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作。取經(jīng)TRIzol法抽提總RNA后的0h，1 h，2 h，4 h，6 h 和 8 h 分別置于 200 μL 小 Ep 管中，每管按以下順序加入 DEPC－treated water(RNA 模板)9μL，Control GAPDH RNA 2 μL，Random hexamer primer 1 μL，5 × Reaction Buffer 4 μL，RiolockTMRNase Inhibitor 1 μL，10 m MdNTP mix 2 μL，Revert AidTMM － Mulv Reverse Transcriptase 1μL，冰上操作，離心 10 000 rpm 1min后，置于 PCR儀中25℃ 5 min、42℃ 60 min、70℃ 5 min?？偡磻?yīng)體系20 μL。

1.7.2 PCR反應(yīng) 各組基因產(chǎn)物均以GAPDH基因作內(nèi)參對照。采用50 μL反應(yīng)體系:cDNA 3 μL，10 × Buffer 5 μL，dNTP 1.5 μL，Taq 酶0.5 μL，Mg2+3 μL，GAPDH 上、下游引物各 1.5 μL，TLR2上、下游引物各5 μL，DEPC 24 μL。反應(yīng)條件:熱啟動94℃ 3 min，94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35 個循環(huán)后，72℃ 5 min降至4℃ 結(jié)束反應(yīng)。

1.7.3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳鑒定 制膠:0.3 g瓊脂與20 mL TBE充分溶解后加入3 μL EB混勻，制備1.5%瓊脂糖凝膠。加樣:各孔依次加入10 μL Mark，15 μL 0h 樣品 +3 μL 6 × Loading Buffer，15 μL 1h 樣品 +3 μL 6 × Loading Buffer，15 μL 2 h 樣品 +3 μL 6 × Loading Buffer，15 μL 4 h 樣品 +3 μL 6 × Loading Buffer，15 μL 6h 樣品 +3 μL 6 × Loading Buffer，15 μL 8 h 樣品 +3 μL 6 × Loading Buffer。電泳條件:U=100V，A=90mA，TBE作緩沖液電泳，電泳結(jié)束后紫外凝膠成像分析儀觀察并記錄結(jié)果。

1.8 免疫熒光法檢測p－STAT3蛋白表達(dá)、STAT－3核轉(zhuǎn)位 采用細(xì)胞爬片法，分別取0 h，1 h，2 h，4 h，6 h和8 h混合培養(yǎng)時間點的 DC2.4細(xì)胞片，吸出孔內(nèi)液體，用自制微型蓋玻片夾夾出小蓋玻片，PBS輕輕沖洗3次，每片加入－20℃甲醇細(xì)胞固定10 min，去固定液，用PB5輕輕沖洗3次，瀝干水分，切勿干燥。將其置于干凈的載玻片上，每玻片加入40 μL p－Stat3(Ser727)單克隆抗體(用1%BSA/PBS按1∶200稀釋)4℃冰箱過夜，PBS洗3次，然后用1∶100(1%BSA/PBS)稀釋的FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG 30 μL于暗濕盒作用40 min，PBS輕輕沖洗5次，自然干燥，丙三醇/PBS封片，用無熒光軟布擦凈其背面，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞p－STAT3蛋白表達(dá)。以上述相同方法檢測DC2.4細(xì)胞STAT－3核轉(zhuǎn)位。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理 實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，細(xì)胞侵入率以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，各樣本均數(shù)先進(jìn)行方差齊性檢驗，再行單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗，P＜0.05表示差異值有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 V.vulnificus1.1758 與 DC2.4 細(xì)胞混合培養(yǎng) 混合培養(yǎng)1 h后，即有細(xì)菌侵入，侵入率為(7.8±0.8)%，培養(yǎng) 2 h，4 h，6 h，8 h 后，DC2.4 細(xì)胞的侵入率分別為(13.9 ±1.1)%、(34.6 ±4.9)%、(77.8 ±10.2)%和(95.8 ±13.1)%?；旌吓囵B(yǎng) 2 h后的細(xì)菌侵入率與培養(yǎng)1 h相比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)(見圖1)。

圖1 創(chuàng)傷弧菌1.1758菌株侵入DC2.4細(xì)胞(Giemsa染色，×400)

2.2 FACS檢測DC2.4細(xì)胞的凋亡 流式細(xì)胞儀結(jié)合Annexin V－FITC標(biāo)記法檢測發(fā)現(xiàn)，混合培養(yǎng)2 h，4 h，6 h組的細(xì)胞凋亡率顯著高于對照組(P＜0.05)(見圖2)。

2.3 STAT3 mRNA的表達(dá) 細(xì)胞總RNA瓊脂糖凝膠電泳分析表明，混合培養(yǎng)1h STAT3 mRNA相對表達(dá)量(79.9±13.1)%與0 h對照組(82.3±12.5)%相比，無顯著性差異(P＞0.05);而混合培養(yǎng)2 h，4 h，6 h，8 h 后，STAT3 mRNA 相對表達(dá)量逐步降低，與0 h對照組比較，有顯著差異(P＜0.05)(見圖3)。

2.4 免疫熒光法檢測STAT3蛋白的表達(dá) 免疫熒光法觀察到隨 V.vulnificus1.1758作用 DC2.4細(xì)胞時間延長，混合培養(yǎng)2 h后，p－STAT3蛋白表達(dá)量呈下降趨勢(見圖4);STAT3在混合培養(yǎng)2h后，也出現(xiàn)胞核內(nèi)聚集現(xiàn)象(見圖5)。

圖5 免疫熒光技術(shù)檢測小鼠DC2.4細(xì)胞STAT3核轉(zhuǎn)位(×400)

3 討論

創(chuàng)傷弧菌(Vibrio vulnificus，Vv)屬嗜鹽性革蘭陰性弧菌，存在于自然界的海水環(huán)境中。人類可通過生食受創(chuàng)傷弧菌污染的海產(chǎn)品或經(jīng)傷口感染進(jìn)入機(jī)體內(nèi)，引起嚴(yán)重的胃腸炎、原發(fā)性敗血癥、肌膜炎等［1－2］。創(chuàng)傷弧菌感染常發(fā)生于歐洲、美洲、亞洲等區(qū)域的沿海城市，在我國，香港、臺灣、廣東、浙江等地有相關(guān)病例報道［3］。自1970年，Roland首次報道創(chuàng)傷弧菌可引起嚴(yán)重的組織壞疽和急性感染性休克以來，人們開始對創(chuàng)傷弧菌的致病機(jī)制及特異性免疫防治等方面進(jìn)行了廣泛研究。由于創(chuàng)傷弧菌具有高致病性和高致死率的特點，其致病機(jī)制一直為人們所關(guān)注。研究表明，病原微生物誘導(dǎo)宿主吞噬細(xì)胞凋亡是不少病原菌感染發(fā)生、發(fā)展的重要機(jī)制，細(xì)胞凋亡的發(fā)生受多種因子調(diào)控［7－9］。DC作為機(jī)體內(nèi)重要的抗原提呈細(xì)胞，在抗創(chuàng)傷弧菌的固有和適應(yīng)性免疫中起著始動者的作用，創(chuàng)傷弧菌誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞發(fā)生凋亡時，STAT3信號分子的作用值得深入研究。本研究結(jié)果顯示，V.vulnificus1.1758與 DC2.4細(xì)胞混合培養(yǎng)后，1h即有細(xì)菌侵入，且創(chuàng)傷弧菌主要以黏附或附著方式集中生長于細(xì)胞表面，DC胞內(nèi)可見到中毒顆粒，細(xì)胞變圓，體積縮小;FACS檢測結(jié)果顯示，混合培養(yǎng)2h，4h，6h 后，DC2.4 細(xì)胞的凋亡率也顯著高于對照組(P＜0.05)。由此我們推測:創(chuàng)傷弧菌在感染早期即可侵入DC2.4細(xì)胞，并誘導(dǎo)DC2.4細(xì)胞發(fā)生嚴(yán)重的凋亡，這可能是創(chuàng)傷弧菌感染后，病程進(jìn)展快、致病力強(qiáng)、致死率高的原因之一。

STAT(signal transducers and activators of transcription)是一類存在于胞漿中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子，STAT3作為其中一個重要成員，在細(xì)胞的生長、存活、增值、分化中起重要作用［10－11］。STAT3常以非活化形式存在于胞漿中，當(dāng)細(xì)胞因子配體與胞膜受體結(jié)合后引起受體二聚化，繼而激活JAK蛋白，JAK蛋白使受體磷酸化，形成受體 －STAT復(fù)合物，之后JAK蛋白使STAT蛋白磷酸化，磷酸化的STAT蛋白脫離受體復(fù)合物并與同類或異類磷酸化STAT蛋白形成同型或異型二聚體，進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)引起基因表達(dá)。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn):DC STAT3 mRNA相對表達(dá)量隨著混合培養(yǎng)時間的延長逐步降低，p－STAT3蛋白表達(dá)量呈下降趨勢，并出現(xiàn)胞核內(nèi)聚集現(xiàn)象。因此，我們推測:在V.vulnificus1.1758侵入 DC2.4細(xì)胞2h后，即可引起STAT3 mRNA的相對表達(dá)量下降及p－STAT3蛋白在胞內(nèi)的表達(dá)量逐步降低，同時，STAT3出現(xiàn)核內(nèi)轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，最終誘導(dǎo)DC發(fā)生細(xì)胞凋亡。

本研究表明，創(chuàng)傷弧菌可通過降低樹突狀細(xì)胞內(nèi)STAT3 mRNA的相對表達(dá)量，抑制胞內(nèi) p－STAT3蛋白的表達(dá)，從而誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞凋亡，這為進(jìn)一步揭示創(chuàng)傷弧菌的致病機(jī)制提供了實驗依據(jù)。

［1］Yuarn－Jang Lee，Yin－Ching Chuang.Ibuprofen augments pro－inflammatory cytokine release in a mouse model of Vibrio vulunficus infection［J］.Microbiol Immunol，2010，54:542 －550.

［2］Lee K J，Lee N Y，Han Y S，et al.Functional characterization of the ilpA protein of Vibrio vulnificus as an adhesin and its role in bacterial pathogenesis［J］.Infect and Immunity，2010，78(6):2408–2417.

［3］盧中秋，李秉熙，黃唯佳，等.創(chuàng)傷弧菌敗血癥的臨床和流行病學(xué)特點［J］.中國急救醫(yī)學(xué)，2003，23(7):470 －471.

［4］王志剛，邵平揚(yáng)，徐水凌，等.創(chuàng)傷弧菌感染樹突狀細(xì)胞的定位及對細(xì)胞骨架影響的實驗研究［J］.中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，2011，31(9):771－775.

［5］Akifusa S，Kamio N，Shimazaki Y，et al.Involvement of the JAK－STAT pathway and SOCS3 in the regulation of adiponectin－generated reactive oxygen species in murine macrophage RAW 264 cells［J］.J Cell Biochem，2010，111(3):597－606.

［6］Wang T，Niu G，Kortylewski M，et al.Regulation of the innate and adaptive immune responses by Stat－3 signaling in tumor cells［J］.Nat Med，2004，10(1):48 ～54.

［7］Iwasaki A，Medzhitov R.Regulation of adaptive immunity by the innate immune system［J］.Science，2010，327(5963):291－295.

［8］秦瑤，鄭洪，楊永福，等.凋亡調(diào)控因子XIAP對缺氧誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響［J］.遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2011，34(5):477 －479.

［9］代垠，焦松，任光陽，等.血管壁ICAM－1和細(xì)胞凋亡在大鼠腦血管痙攣中作用的實驗研究［J］.遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2011，34(6):477 －479.

［10］Levy D E，Darnell J E Jr.Stats:transcriptional control and biological impact［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2002，3(9):651－662.

［11］Rawlings J S，Rosler K M，Harrison D A.The JAK/STAT signaling pathway［J］.J Cell Sci，2004，117(Pt 8):1281－1283.