白建偉，李 巖

(遵義醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，貴州遵義 563099)

利谷隆(Linuron，LIN)即1－甲氧基－1－甲基－3－(3，4－二氯苯基)脲，是一種取代脲類(lèi)低毒農(nóng)藥除草劑，對(duì)一年生禾本科雜草，如馬唐、狗尾草有很好的防除效果。由于LIN具有無(wú)致畸、致癌和誘變效應(yīng)且組織殘留少，副作用小等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于糧食及果樹(shù)的種植中。然而近期研究發(fā)現(xiàn)LIN具有抗雄激素樣作用，與雄激素競(jìng)爭(zhēng)細(xì)胞表面雄激素受體(androgen receptor，AR)，干擾受體細(xì)胞內(nèi)雄激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)而抑制雄激素生物學(xué)功能［1］。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)LIN的抗雄性激素樣作用主要通過(guò)LIN的中間代謝產(chǎn)物3，4－二氯苯胺競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合AR抑制睪酮的合成而實(shí)現(xiàn)的［2］。研究結(jié)果表明LIN具有生殖毒性作用［3］。

目前有關(guān)具有抗雄激素樣作用除草劑的生殖毒性報(bào)道，多是對(duì)親代SD大鼠生殖器官及激素水平上表征其雄性生殖毒性的研究，如李巖等發(fā)現(xiàn)氟他胺通過(guò)對(duì)生成睪酮細(xì)胞器的毒性損害和關(guān)鍵酶的抑制，降低了睪酮的分泌量，從而阻礙了性分化和性發(fā)育［4］。而有關(guān)抗雄性激素物質(zhì)LIN致生殖發(fā)育毒性機(jī)理的尚未清楚。本文從親代SD大鼠妊娠期灌服LIN，對(duì)F1代雄性SD大鼠生殖毒性的影響及睪丸差異基因表達(dá)、鑒定及分析等方面展開(kāi)研究，以期為進(jìn)一步深入了解LIN致生殖發(fā)育毒性的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組及處理 選取清潔級(jí)Sprague Dawley(SD)大鼠性成熟個(gè)體，雄鼠12只，雌鼠24只，體重200±5 g，由第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。將大鼠隨機(jī)分為兩組，利谷隆組與對(duì)照組，按雌雄2∶1分籠交配，室溫24℃;獲取妊娠雌性SD鼠，利谷隆灌服組于妊娠12 d至17 d灌服濃度為24 mg/mL的利谷隆懸濁液，對(duì)照組灌服花生油;于SD鼠孕期第20天解剖取胎鼠，獲得胎鼠每組40只，提取睪丸組織中RNA進(jìn)行基因芯片分析。

1.2 兩組子代雄性SD大鼠睪丸組織差異基因譜芯片檢測(cè)

1.2.1 總RNA的提取及鑒定 用Trizol(Invitrogen公司)提取睪丸組織總RNA。紫外分光光度計(jì)檢測(cè)OD值，要求 A260/A280比值介于1.8～2.0之間，根據(jù) A260計(jì)算總 RNA含量。溴化乙錠(Ethidium bromide，EB)染色，1%瓊脂糖凝膠電泳觀察其完整性。

1.2.2 差異基因譜芯片雜交及分析 差異基因譜芯片雜交委托上海博豪生物科技有限公司完成。芯片結(jié)果采用GeneChip?Scanner 3000(P/N 00－00212，Affymetrix)進(jìn)行掃描，用 Command Console Software 3.1(Affymetrix)讀取原始數(shù)據(jù)，質(zhì)控合格的數(shù)據(jù)采用Gene Spring Software 11.0(Agilent)進(jìn)行歸一化處理，所用的算法為MAS5.0。運(yùn)用Affymetrix網(wǎng)上分析中心通過(guò)快速查詢(Quick Query)獲取生殖有關(guān)功能基因的相關(guān)信息。差異基因表達(dá)篩選標(biāo)準(zhǔn):a、以 P＜0.05且 FC≥2為標(biāo)準(zhǔn);b、以 Signal Log Ratio≥1或≤ －1為閾值。

2 結(jié)果

2.1 總RNA完整性檢測(cè) 將提取的子代雄性大鼠睪丸組織總RNA經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳以檢測(cè)總RNA的完整性，檢測(cè)結(jié)果(見(jiàn)圖1)，結(jié)果顯示總RNA的28S和18S兩條帶比較清晰完整，表1顯示RNA經(jīng)分析表明28S與18S的比值均在1.5左右，經(jīng)核酸濃度測(cè)定儀檢測(cè)A260/A280比值為1.9～2.0，表明提取的總 RNA 無(wú)降解，純度高，可用于基因表達(dá)譜芯片雜交。

圖1 子代雄性大鼠睪丸組織總RNA瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)

表1 RNA質(zhì)量分析

2.2 利谷隆染毒組子代雄性SD大鼠睪丸組織差異基因譜芯片結(jié)果

2.2.1 基因差異表達(dá)結(jié)果 與對(duì)照組相比，本試驗(yàn)從基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫(kù)中，以P－value小于0.05且FC≥2倍的篩選標(biāo)準(zhǔn)一共篩選到168個(gè)差異表達(dá)基因，以Signal Log Ratio≥1或≤－1為閾值分別篩選出89個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，79個(gè)基因表達(dá)下調(diào)(見(jiàn)圖2)。運(yùn)用Affymetrix網(wǎng)上分析中心通過(guò)快速查詢(Quick Query)獲取與生殖功能相關(guān)的差異表達(dá)基因的相關(guān)信息(見(jiàn)表2)。

圖2 基因芯片雜交結(jié)果火山圖

2.2.3 差異表達(dá)基因功能分析 差異表達(dá)基因經(jīng)GO分析，知其分子功能主要參與催化活性(cata lytic activity)(26.2%)、結(jié)合活性(binding activity)(24.7%)及轉(zhuǎn)運(yùn)活性(transport activity)(20%);經(jīng)生物學(xué)過(guò)程分析結(jié)果得知差異表達(dá)基因參與了代謝過(guò)程(metabolism)(10%)、生物學(xué)調(diào)控(biological regulation)(8.6%)、發(fā)育過(guò)程(developmental process)(7.6%)、生物過(guò)程調(diào)控(regulation of biological process)(6.5%);通過(guò)DAVID軟件對(duì)差異表達(dá)基因的通路分析得知，差異表達(dá)基因表達(dá)產(chǎn)物參與了PI3K、AMPK、胰島素信號(hào)通路、mTOR信號(hào)通路等信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程。

3 討論

隨著基因組技術(shù)作為一種高探索性研究的重要工具被廣泛應(yīng)用于毒理學(xué)研究時(shí)，毒理基因組學(xué)亦成為一門(mén)新興學(xué)科得到大量的研究報(bào)道。毒理基因組學(xué)可以快速的檢測(cè)有毒物質(zhì)作用于生物體后基因組表達(dá)的變化，揭示其可能的致毒機(jī)理［5］。然而許多有關(guān)生殖毒理差異基因表達(dá)的研究?jī)H僅局限于致毒物質(zhì)對(duì)生物體基因變化的研究，反而忽略了動(dòng)物毒理實(shí)驗(yàn)與毒理基因組學(xué)聯(lián)合實(shí)驗(yàn)的研究［6］。

基因芯片結(jié)果表明有6個(gè)差異表達(dá)基因參與了生殖(reproduction)發(fā)育過(guò)程，這些與生殖相關(guān)的基因在利谷隆灌服的子代雄性SD大鼠睪丸組織中發(fā)生了差異性表達(dá)，說(shuō)明利谷隆致雄性生殖毒性可能是通過(guò)誘導(dǎo)這些基因發(fā)生差異表達(dá)所介導(dǎo)的。表2結(jié)果顯示妊娠期第12～17天連續(xù)每天灌120mg/kg體重劑量的利谷隆，與花生油灌服對(duì)照組比較，利谷隆灌服組的雄性子代大鼠睪丸組織中StAR、3β － HSD、P450scc、ABP、5α － 還原酶等與雄性生殖生理密切相關(guān)基因均下調(diào)表達(dá)，而Cox7a2等基因上調(diào)表達(dá)。

雄激素的合成是由膽固醇經(jīng)一系列酶催化作用而生成的，膽固醇經(jīng)線粒體內(nèi)膜由類(lèi)固醇激素合成急性調(diào)節(jié)蛋白(steroidogenic acute regulatory protein，StAR)蛋白完成，膽固醇裂解為孕烯醇酮由細(xì)胞色素P450側(cè)鏈裂解酶(cytochrome P450，family 11，subfamily a，P450scc)催化，孕烯醇酮變成孕酮由3β－羥甾脫氫酶(hydroxy－delta－5－steroid dehydrogenase，3β－HSD)催化，這3個(gè)反應(yīng)構(gòu)成了類(lèi)固醇激素合成的限速步驟。StAR、3β－HSD、P450scc三者在雄性生殖中具有重要的作用，一些研究表明利谷隆及其他抗雄性激素均可誘導(dǎo)其表達(dá)變化，與Wilson等的報(bào)道不同的是，Wilson等報(bào)道利谷隆不可誘導(dǎo)StAR基因的表達(dá)差異［7］;Barlow等與Lehmann等報(bào)道鄰苯二甲酸可誘導(dǎo)3β－HSD與P450scc的mRNA豐度顯著性降低［8］。這些研究結(jié)果與本試驗(yàn)結(jié)果大致相符，表明利谷隆誘導(dǎo)的雄性生殖毒性可能是通過(guò)抑制睪酮合成相關(guān)酶的基因表達(dá)，干擾了睪酮的生物合成過(guò)程。

另外，Cox7a2抑制LH誘導(dǎo)的睪酮合成，降低stAR蛋白的表達(dá)，升高ROS水平，該研究結(jié)果表明Cox7a2可通過(guò)抑制類(lèi)固醇合成快速調(diào)節(jié)蛋白StAR的表達(dá)調(diào)控睪酮分泌，和增高ROS水平有關(guān)［9］。這些都證實(shí)了利谷隆具有抗雄性激素樣作用。

研究表明，利谷隆染毒可能通過(guò)改變睪丸發(fā)育相關(guān)基因及睪酮合成相關(guān)基因的表達(dá)異常，是導(dǎo)致SD雄性子代大鼠生殖發(fā)育毒性的機(jī)制之一。

［1］Chen C D，Welsbie D S，Tran C，et al.Molecular determinants of resistance to antandrogen therapy［J］.Nat Med，2004，10(1):33 －39.

［2］Guo D，Yi X，Qu L.Determination of linuron and its metabolite 3，4 － dichloroaniline residues in meat and meat products using liquid chromatography－tandem mass spectrometry［J］.Se Pu，2011，29(10):967 －973.

［3］McIntyre B S，Barlow N J，Sar M，et al.Effects of in utero linuron exposure on rat Wolffian duct development［J］.Reprod Toxicol，2002，16(2):131 －139.

［4］李巖，張浩，吳德生.氟他胺對(duì)F1雄性大鼠睪酮分泌的影響機(jī)制［J］.遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，30(1):1 －3.

［5］Aubrecht J，Kleinjans J C.Application of toxicogenomics to study mechanisms of genotoxicity and carcinogenicity［J］.Toxicology Letters，2009，186(1):36 －44.

［6］Ludwig S，Tinwell H，Schorsch F，et al.A molecular and phenotypic integrative approach to identify a no－effect dose level for antiandrogen－induced testicular toxicity［J］.Toxicol Sci，2011，122(1):52 －63.

［7］Wilson V S，Lambright C R，F(xiàn)urr J R，et al.The herbicide linuron reduces testosterone production from the fetal rat testis during both in utero and in vitro exposures［J］.Toxicol Lett，2009，186(2):73 －7.

［8］Barlow N J，Bowman C J，F(xiàn)oster P M.Altered gene expression during rat Wolffian duct development in response to in utero exposure to the antiandrogen linuron［J］.Toxicol Sci，2003，74(1):114 － 128.

［9］陳亮，辛鐘成，田龍，等.Cox7a2對(duì)睪酮合成及StAR、P450scc和3β－HSD蛋白表達(dá)影響研究［J］.中國(guó)男科學(xué)雜志，2006，20(9):2 －6.