徐海燕,唐薇薇,李麗娟
(遵義醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室,貴州遵義 563099)
急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)是外科常見的急腹癥,雖然其病因各不相同,但其病理過程均始于胰腺腺泡破壞引起胰腺組織發(fā)生急性炎癥,繼而病變局灶處釋放大量的炎性細(xì)胞因子,通過“扳機(jī)樣作用”觸發(fā)炎癥介質(zhì)的“瀑布樣級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)”,使AP易于從局部病變發(fā)展成為全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS),并進(jìn)一步出現(xiàn)肺、腎、心、腦、肝等多臟器的損傷,甚至出現(xiàn)多器官功能衰竭(multiple organ failure,MOF)而致患者死亡,這是AP嚴(yán)重演變的根源[1-2]。肺是AP最常累及的器官之一,急性肺損傷(acute lung injury,ALI)是AP患者發(fā)生死亡的重要原因[3]。目前已經(jīng)證實(shí),細(xì)胞鈣超載和核因子 -κB(Nuclear factor-kappa B,NF-κB)活化在AP炎癥級(jí)聯(lián)放大過程中發(fā)揮極為關(guān)鍵的作用[4]。已有研究表明,蛋白激酶 C(protein kinase c,PKC)與細(xì)胞鈣通道的活動(dòng)和NF-κB的活化有關(guān)[5-8],但PKC是否參與AP發(fā)病中的細(xì)胞內(nèi)鈣超載和NF-κB活化,并造成包括ALI在內(nèi)的多器官功能損害,目前尚不清楚。
本研究采用經(jīng)典方法復(fù)制大鼠膽源性AP動(dòng)物模型,觀測(cè)AP大鼠肺組織傳統(tǒng)型蛋白激酶Cα(Classical protein kinase c α ,cPKCα)的變化,以探討cPKCα在AP引發(fā)的ALI中的可能作用,從而為AP的防治提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
1.1 藥品與試劑 戊巴比妥鈉(上海化學(xué)試劑公司進(jìn)口分裝);?;敲撗跄懰徕c(上?;瘜W(xué)試劑站分裝廠);小鼠抗大鼠cPKCα多克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司);淀粉酶試劑盒和總蛋白試劑盒(南京建成生物工程研究所);即用型SABC免疫組化染色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。
1.2 動(dòng)物分組 健康SD大鼠32只,雌雄不拘,體重220±20 g,鼠齡8~12周,由上海貝凱公司提供。將動(dòng)物隨機(jī)分為2組:假手術(shù)(SO)組(n=16)和急性胰腺炎(AP)組(n=16)。
1.3 AP模型復(fù)制 受試動(dòng)物于實(shí)驗(yàn)前禁食12 h,自由飲水。參照文獻(xiàn)方法[9]復(fù)制AP模型,即經(jīng)胰膽管逆行加壓注射3%?;敲撗跄懰徕c(0.1 mL/100 g,推注速度為0.05 mL/30s),SO 組僅開腹暴露胰腺并輕輕翻動(dòng),余操作步驟相同。
1.4 標(biāo)本采集與測(cè)定
1.4.1 大鼠胰腺組織學(xué)檢查 各組大鼠在接受相應(yīng)處理后4 h、8 h,留取相同部位的胰腺及肺組織,采用10%福爾馬林固定后,常規(guī)石蠟包埋組織切片,HE染色,光鏡下觀察其組織病理變化。
1.4.2 大鼠血清淀粉酶(amylase,AMY)活性檢測(cè) 各組動(dòng)物于相應(yīng)處理后4 h、8 h,頸動(dòng)脈采血2 mL,分離血漿后,采用721型分光光度計(jì),用AMY測(cè)定試劑盒(碘-淀粉比色法)于660 nm處比色,檢測(cè)AMY活性(U/L)。
1.4.3 檢測(cè)大鼠肺組織cPKCα的蛋白表達(dá)變化 在各組大鼠接受相應(yīng)處理后4 h、8 h,留取肺尖部組織,用常規(guī)方法制備成石蠟切片,采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)肺組織cPKCα的表達(dá)變化。具體操作步驟如下:①肺組織切片脫蠟至水化后,用胰酶在37℃條件下消化20 min,水洗;②0.3%H2O2甲醇液孵育10 min,水洗后用PBS液沖洗2次,5 min/次;③用牛血清白蛋白在室溫條件孵育15 min,去掉組織切片上的液體;④直接滴加小鼠抗大鼠cPKCα多克隆抗體,放置于濕盒中4℃過夜,PBS液沖洗3次,5 min/次;⑤滴加IgG二抗,于37℃孵育20 min后,用PBS液沖洗3次,5 min/次;⑥滴加SABC工作液,在37℃條件下孵育20 min,PBS液沖洗3次,5 min/次;⑦DAB顯色后自來水沖洗;⑧蘇木素復(fù)染,通過無水乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片后,光鏡下觀察結(jié)果。用PBS代替特異性抗體作空白對(duì)照。
1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,組間比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 組織學(xué)變化 AP組大鼠胰腺外觀充血水腫,體積增大,顏色變暗,可見多個(gè)暗褐色壞死灶,光鏡下觀察到胰腺腺泡表現(xiàn)為不同程度的腫脹,間質(zhì)可見大量炎性細(xì)胞浸潤及出血,隨時(shí)間延長出現(xiàn)不同程度的局灶性或片狀壞死,8 h胰腺組織中可見灶狀鈣皂形成;AP組大鼠肺組織呈現(xiàn)不同程度的充血性改變,包膜下可見點(diǎn)、片狀出血灶,光鏡下見肺泡壁增厚,肺間質(zhì)水腫、出血、大量炎性細(xì)胞浸潤,以8 h為顯著。
2.2 血漿AMY的活性改變 AP大鼠各時(shí)間點(diǎn)血漿AMY的活性顯著增高,以8 h為著,與SO組相比較,差異具有顯著性(P<0.05,見圖1)。
圖1 各組大鼠血漿AMY的活性比較
2.3 肺組織cPKCα的變化 免疫組織化學(xué)方法發(fā)現(xiàn):cPKCα定位于細(xì)胞漿,陽性細(xì)胞在胞漿內(nèi)呈現(xiàn)棕黃色顆粒。SO組大鼠肺組織細(xì)胞漿內(nèi)僅見少量棕黃色顆粒,無明顯細(xì)胞膜聚集的現(xiàn)象;而AP組大鼠的細(xì)胞漿可見大量棕黃色顆粒,且棕黃色顆粒聚集于細(xì)胞膜的一側(cè),以8h為著(見圖2)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示:AP組大鼠肺組織cPKCα蛋白的表達(dá)及活性明顯增高。
圖2 各組大鼠肺組織cPKCα的表達(dá)及活性比較典型圖例(8h)×200
研究表明,ALI為AP尤其是急性重癥胰腺炎常見的并發(fā)癥,是AP患者病情危重演變導(dǎo)致死亡的重要原因。大量研究表明,AP時(shí)的肺損傷與肺組織內(nèi)大量中性粒細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞積聚、活化,釋放大量促炎因子有關(guān)[10-11],但其具體機(jī)制尚不清楚。
PKC是真核生物中一類主要的蛋白激酶,有12種亞型,屬于絲氨酸蘇氨酸激酶超家族。PKC參與了細(xì)胞的生長分化、增殖、基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞骨架蛋白的重塑等生物活動(dòng)。在靜息狀態(tài)時(shí),PKC以無活性的形式存在于胞漿,當(dāng)其被激活時(shí)從胞漿轉(zhuǎn)移至胞膜。cPKCs是PKC分布最為廣泛的一類,包括 α、β1、β2、γ 四類。已有研究證實(shí),各種途徑引起的cPKCα活化,均可導(dǎo)致前列腺素E2、肺泡上皮細(xì)胞環(huán)氧化酶及單核細(xì)胞TNFα等的基因表達(dá)增加,其機(jī)制與cPKCα激活NF-κB有關(guān);此外,有學(xué)者發(fā)現(xiàn),cPKCα激活后可引起細(xì)胞膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的鈣通道開放,使細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度升高[5-8,12]??梢?,cPKCα 參與細(xì)胞內(nèi) NF - κB 活化及鈣離子濃度的調(diào)節(jié)。
大量研究已經(jīng)證實(shí),AP炎癥級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)與細(xì)胞內(nèi)鈣超載及NF-κB活化密切相關(guān)。有研究表明,cPKCα 的活化參與 AP的發(fā)生和發(fā)展[13-14],但cPKCα-細(xì)胞鈣超載-NF-κB活化通路與AP的關(guān)系尚不清楚。本課題通過向胰管內(nèi)逆行加壓注射3%?;敲撗跄懰徕c,復(fù)制大鼠膽源性AP,AP復(fù)制成功后4h和8h均可觀察到:肺組織細(xì)胞cPKCα的表達(dá)明顯增加,且表達(dá)的cPKCα主要聚集于細(xì)胞膜的一側(cè)。根據(jù)cPKCα激活時(shí)從胞漿向胞膜移位的特點(diǎn),本研究認(rèn)為,AP大鼠肺組織cPKCα的表達(dá)及活性均明顯增加,提示cPKCα可能通過影響細(xì)胞鈣超載及NF-κB活化通路參與AP大鼠ALI的發(fā)生。但其具體影響及機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。
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