于 鑫， 李西林*， 夏 晶， 柳國(guó)斌， 牛東霞

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，上海201203;2.上海市食品藥品檢驗(yàn)所職工技術(shù)協(xié)會(huì)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，上海200233;3.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，上海201203)

糖尿病足是糖尿病致殘的嚴(yán)重并發(fā)癥之一［1］，是由于糖尿病外周血管病變和 (或)神經(jīng)病變感染等因素導(dǎo)致足或下肢組織破壞的一種病變［2］。目前，糖尿病足部潰瘍致殘、致死危害之高，給患者及社會(huì)都已帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)［3］。紫朱軟膏是上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院治療糖尿病足的經(jīng)驗(yàn)方，由朱砂、紫草、龍血竭、黃芪、阿膠、冰片六味中藥組成，具有清熱解毒、祛腐生肌、補(bǔ)氣益血之功效。其中，龍血竭為該驗(yàn)方中的要藥，為傳統(tǒng)活血藥材，有“活血之圣藥”的美稱(chēng)［4］，可以祛腐生肌、活血化瘀、止血收斂［5］，并可與多種藥物組成復(fù)方制劑［6-7］，在本經(jīng)驗(yàn)方中對(duì)治療糖尿病足起著重要作用，因此，控制龍血竭的量，對(duì)于建立紫朱軟膏的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和保證其臨床療效具有重要的意義。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1100 Series高效液相色譜儀 (美國(guó)安捷倫公司)，SARTORIUSAG CP 224S型電子天平 (北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)，B5500S-MT型超聲清洗儀 (美國(guó)Branson公司)，Molcell細(xì)胞型超純水機(jī) (上海摩勒生物科技有限公司)，Centrifuge 5810R型離心機(jī) (德國(guó)Eppendorf公司)，Inertsil ODS-3 C18色譜柱 (GL Sciences有限公司)。

1.2 試藥 龍血素B標(biāo)準(zhǔn)品 (中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào):111558-200202)，三氯甲烷 (分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，乙腈 (色譜純，Merck KGaA公司)，硅藻土 (化學(xué)純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)，冰醋酸(分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)，紫朱軟膏為實(shí)驗(yàn)室自制，水為經(jīng)Molcell細(xì)胞型超純水機(jī)處理的超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 試樣溶液的制備

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取龍血素B對(duì)照品10 mg，于10 mL量瓶中，加三氯甲烷定容至刻度，搖勻;取上述溶液2 mL至100 mL量瓶中，加三氯甲烷稀釋至刻度，搖勻;取上述稀釋后溶液10 mL至20 mL量瓶中，水浴揮干三氯甲烷，殘?jiān)右译嫒芙庵量潭?，搖勻，即得對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液 取紫朱軟膏2.5 g，精密稱(chēng)定，加硅藻土5 g，研磨混合均勻。加冰醋酸溶液 (1→90)-乙腈(1∶1)的混合溶液50 mL，稱(chēng)質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，加冰醋酸-乙腈的混合溶液補(bǔ)質(zhì)量，搖勻，4 000 r/min離心20 min。將上清液過(guò)濾，取續(xù)濾液過(guò)0.45μm有機(jī)微孔濾膜過(guò)濾，即得。

2.2 色譜條件 采用Inertsil ODS-3 C18色譜柱 (4.6 mm×250 mm，5μm)，以冰醋酸 (1→90)-乙腈 (63∶37)為流動(dòng)相;體積流量1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)275 nm;柱溫30℃;進(jìn)樣量10μL。各測(cè)試樣品的圖譜結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 取樣量的考察 分別取紫朱軟膏與硅藻土的混合物5.0g、7.5g、10.0g，精密稱(chēng)定，按供試品溶液處理方法進(jìn)行處理，進(jìn)樣測(cè)定并計(jì)算 (采用外標(biāo)兩點(diǎn)法)。每個(gè)樣品重復(fù)3份，RSD分別為2.10%、1.66%、1.72%。

結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果表明，取樣量對(duì)測(cè)定結(jié)果影響不大，按測(cè)定結(jié)果擇優(yōu)選擇，取樣量確定為7.5 g。

圖1 各測(cè)試樣品HPLC測(cè)定圖譜

表1 取樣量的考察結(jié)果 (n=3)

2.3.2 超聲時(shí)間的考察 取紫朱軟膏與硅藻土的混合物7.5 g，精密稱(chēng)定，按供試品溶液處理方法進(jìn)行處理，超聲處理時(shí)間分別為10、20、30、40 min。進(jìn)樣測(cè)定并計(jì)算(采用外標(biāo)兩點(diǎn)法)。每個(gè)樣品重復(fù)3份，RSD分別為1.58%、1.34%、1.42%、1.66%。結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果表明，超聲處理30 min所測(cè)得的量最高，為最適宜的超聲時(shí)間。所以，超聲時(shí)間確定為30 min。

表2 超聲時(shí)間的考察結(jié)果 (n=3)

2.3.3 提取溶劑比例的考察 取紫朱軟膏與硅藻土的混合物7.5 g，精密稱(chēng)定，按供試品溶液處理方法進(jìn)行處理，分別加入提取溶劑冰醋酸溶液 (1→90)-乙腈 (1∶1)及冰醋酸溶液 (1→90)-乙腈 (1∶2)50 mL。進(jìn)樣測(cè)定并計(jì)算(采用外標(biāo)兩點(diǎn)法)。每個(gè)樣品重復(fù)3份，RSD分別為1.28%，1.44%。結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果表明，提取溶劑冰醋酸溶液 (1→90)-乙腈比例為1∶1優(yōu)于比例為1∶2，故選用提取溶劑為冰醋酸溶液 (1→90)-乙腈 (1∶1)。

表3 提取溶劑比例的考察結(jié)果 (n=3)

2.3.4 提取溶劑用量的考察 取紫朱軟膏與硅藻土的混合物7.5 g，精密稱(chēng)定，按供試品溶液處理方法進(jìn)行處理，分別加入提取溶劑冰醋酸溶液 (1→90)-乙腈 (1∶1)50 mL及100 mL。進(jìn)樣測(cè)定并計(jì)算 (采用外標(biāo)兩點(diǎn)法)。每個(gè)樣品重復(fù)3份，RSD分別為1.97%、2.02%。結(jié)果見(jiàn)表4。結(jié)果表明，50 mL和100 mL提取溶劑對(duì)測(cè)定結(jié)果影響不大，故從節(jié)省溶劑的角度考慮，提取溶劑用量確定為50 mL。

表4 提取溶劑用量的考察結(jié)果 (n=3)

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn) 精密稱(chēng)取龍血素B標(biāo)準(zhǔn)品，以乙腈為溶劑，制 成 質(zhì) 量 濃 度 為 2.100、2.625、3.500、5.250、7.000、10.500、21.000、35.000、70.000、105.000 μg/mL的對(duì)照品溶液。在上述色譜條件下分別進(jìn)樣10μL，記錄峰面積。以標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，所對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo) (運(yùn)用外標(biāo)兩點(diǎn)法)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)?；貧w方程為Y=29.926X－22.357，R2=0.999 5。在 2.100～105.000 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。

2.5 精密度實(shí)驗(yàn) 取對(duì)照品溶液 (10.5μg/mL)，連續(xù)進(jìn)樣5次，每次10μL，按色譜條件測(cè)定，峰面積 RSD為0.62%。

2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取紫朱軟膏供試品溶液，分別于0、1、2、4、10、16、24、48 h，按色譜條件測(cè)定，記錄所測(cè)組分峰面積，計(jì)算龍血素B含有量的RSD為2.46%，表明供試品溶液在0～48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取紫朱軟膏與硅藻土的混合物7.5 g，精密稱(chēng)定，按供試品溶液處理方法進(jìn)行處理，按色譜條件測(cè)定，進(jìn)行6次平行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果龍血素B的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為154.786 5μg/g，RSD為2.94%，表明本方法對(duì)樣品的測(cè)定重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收實(shí)驗(yàn) 取紫朱軟膏與硅藻土的混合物3.75 g，精密稱(chēng)定，分別加入80%、100%、120%的龍血素B標(biāo)準(zhǔn)品溶液，每個(gè)一式三份，按供試品溶液處理方法進(jìn)行處理，按色譜條件測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表5。結(jié)果表明，加樣回收率在90%～110%之間，說(shuō)明方法可靠，結(jié)果準(zhǔn)確。

表5 加樣回收率測(cè)定結(jié)果 (n=3)

2.9 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn) 在不同時(shí)間內(nèi)，選擇兩位實(shí)驗(yàn)人員，對(duì)紫朱軟膏進(jìn)行試驗(yàn)，計(jì)算龍血素B量的相對(duì)平均偏差為1.40%，表明不同人員在不同時(shí)間內(nèi)測(cè)得的龍血素B的結(jié)果基本一致，說(shuō)明方法適用性較強(qiáng)，重現(xiàn)性符合要求。

2.10 樣品測(cè)定 取樣品依法測(cè)定，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3份，結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 紫朱軟膏中龍血竭的測(cè)定結(jié)果 (n=3)

3 討論

龍血竭的質(zhì)量控制手段主要有薄層色譜法、紫外可見(jiàn)分光光度法和高效液相色譜法等對(duì)已知化合物 (如龍血素A、龍血素B等)進(jìn)行定量測(cè)定［8-10］。龍血素B是龍血竭的主要成分，是一種酚類(lèi)化合物［11］。文獻(xiàn)報(bào)道中大多通過(guò)測(cè)定龍血素B的定量來(lái)對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量控制［12］。紫外可見(jiàn)分光光度法測(cè)定龍血素B的方法專(zhuān)屬性較差，并且在復(fù)方制劑中容易受到干擾，因此用高效液相色譜法測(cè)定龍血素B具有更好的專(zhuān)屬性。本研究建立的高效液相色譜法考察了甲醇-冰醋酸水溶液、乙腈-冰醋酸水溶液流動(dòng)相系統(tǒng)，以及不同冰醋酸的量對(duì)分離效果的影響，最后參考相關(guān)文獻(xiàn)［13-15］，采用冰醋酸 (1→90)-乙腈 (63:37)系統(tǒng)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為275nm，能得到較好的分離度，峰形良好，出峰時(shí)間適宜，方法學(xué)考察符合要求，可用于紫朱軟膏中龍血竭的質(zhì)量控制。

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