李仲秋， 鄒 龍， 劉 輝， 李歡歡， 夏新華

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410208)

在中藥制劑制備工藝研究中，如何有效去除非藥用部分，充分保留有效成分、同時(shí)降低制劑的吸濕性一直是研究的重要內(nèi)容。醇沉法是運(yùn)用較廣泛的傳統(tǒng)精制純化方法。近年來(lái)，一些新材料、新技術(shù)已運(yùn)用于中藥水提液的純化中，其中絮凝澄清法應(yīng)用較多，該法在保留有效成分、降低吸濕性等方面優(yōu)于傳統(tǒng)醇沉法［1-3］，尤其對(duì)麻黃堿、芍藥苷、綠原酸、黃酮、多糖等成分較醇沉法具有更高保留率［4］。

關(guān)于殼聚糖絮凝澄清法和醇沉工藝優(yōu)劣比較的研究較多［5-6］，但尚未見有關(guān)兩者對(duì)中藥中游離氨基酸量影響的報(bào)道。乙肝寧復(fù)方是由黃芪、茵陳、白芍等十三味中藥組成的治療慢性遷延性肝炎的臨床有效驗(yàn)方，具有健脾化濕、滋腎養(yǎng)肝、活血化瘀等作用。黃芪系方中君藥，對(duì)于黃芪甲苷、芍藥苷、川楝素等有效成分的測(cè)定方法已有相關(guān)報(bào)道［7-9］，而對(duì)無(wú)效成分氨基酸未見相關(guān)研究。本課題以乙肝寧復(fù)方為模型藥物，早期研究表明:殼聚糖絮凝澄清法較醇沉法可更好降低乙肝寧浸膏的吸濕性［3］。本實(shí)驗(yàn)旨在研究從乙肝寧復(fù)方水提液中分離得到的氨基酸的吸濕性強(qiáng)弱，以及上述兩種工藝純化乙肝寧復(fù)方水提液后3種氨基酸量變化，闡述在絮凝澄清法降低中藥浸膏吸濕性中氨基酸的作用，為殼聚糖絮凝澄清工藝用于中藥水提液的精制純化提供依據(jù)。

1 儀器、材料和試藥

1.1 儀器 Agilent 1200型高效液相色譜儀，配置G1329A自動(dòng)控溫進(jìn)樣器、Agilent 1200可調(diào)波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器、HT-230A柱溫箱、Agilent 1200工作站(Agilent公司);AR1140電子分析天平 (奧豪斯國(guó)際貿(mào)易有限公司);TD5A-WS臺(tái)式低速離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器開發(fā)有限公司);PHS-25實(shí)驗(yàn)室pH計(jì) (上海理達(dá)儀器廠);DF101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 (鞏義予華儀器有限責(zé)任公司);XW-80A微型旋渦混合儀 (上海滬西分析儀器廠有限公司)。

1.2 材料和試藥 乙肝寧各味藥材均購(gòu)自安徽惠隆中藥飲片有限公司，經(jīng)鑒定符合《中國(guó)藥典》2010年版一部規(guī)定;茚三酮 (上海山浦化工有限公司);氨水 (重慶川東化工有限公司);732號(hào)陽(yáng)離子交換樹脂 (國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);活性炭 (天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司);精氨酸、脯氨酸、賴氨酸 (Br，Amresco公司);異硫氰酸苯酯 (PITC)(上海金山亭新化工試);三乙胺 (湖南匯虹試劑有限公司);冰醋酸 (汕頭市西隴化工有限公司);乙酸鈉 (西安化學(xué)試劑廠);乙腈 (色譜純);水為重蒸餾水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 乙肝寧復(fù)方總游離氨基酸的吸濕性考察

2.1.1 乙肝寧水提液的制備 參照2010版《中國(guó)藥典》 “乙肝寧顆?！碧幏奖壤Q取214 g生藥(除黃芪)［10］，加10倍量水浸泡30 min，回流提取2 h，過濾，濾渣加8倍量水回流提取2 h，過濾，合并濾液，濃縮，備用。

2.1.2 總游離氨基酸的分離純化 將上述乙肝寧復(fù)方水提液濃縮至一定體積，調(diào)pH值至2.50，上732號(hào)陽(yáng)離子交換樹脂柱，直至茚三酮反應(yīng)為陰性，靜置吸附2 h。蒸餾水洗滌，直至糖檢測(cè) (α-萘酚濃硫酸Molish反應(yīng))為陰性，pH值為中性。2%氨水溶液洗脫，收集茚三酮反應(yīng)為陽(yáng)性部分的洗脫液，減壓濃縮，上顆?；钚蕴恐揭欢〞r(shí)間后，用蒸餾水洗脫，收集茚三酮反應(yīng)為陽(yáng)性反應(yīng)的洗脫液，濃縮，真空干燥，即得。

2.1.3 吸濕百分率的測(cè)定 配制氯化鈉過飽和溶液，置于玻璃干燥器中，放入25℃的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)24 h，使其相對(duì)濕度達(dá)75%。取經(jīng)上述方法分離純化后的氨基酸分離物干浸膏和未經(jīng)任何處理的原浸膏供試品適量，研細(xì)，分別置P2O5干燥器內(nèi)干至恒定質(zhì)量。精密稱定已恒定質(zhì)量的稱量瓶，并放入厚約2 mm的供試品粉末，精密稱定后置于上述玻璃干燥器內(nèi)，25℃保存，定時(shí)稱量，計(jì)算吸濕百分率，以吸濕百分率 (%)為縱坐標(biāo)，時(shí)間(h)為橫坐標(biāo)作圖。結(jié)果表明，氨基酸分離物吸濕性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于乙肝寧復(fù)方原浸膏，具有較強(qiáng)吸濕性(見圖1)，可能對(duì)乙肝寧浸膏吸濕性有影響。

圖1 乙肝寧復(fù)方總游離氨基酸及原浸膏吸濕曲線Fig.1 Moisture absorption curves of total free-amino acids in Yiganning compound prescription and untreated Yiganning aqueous extract

2.2 兩種純化方法對(duì)乙肝寧復(fù)方水提液中3種吸濕性氨基酸影響的考察

2.2.1 乙肝寧水提液的制備及其純化處理

(1)乙肝寧水提液的制備 按2.1.1項(xiàng)下方法制備乙肝寧復(fù)方水提液，濃縮至1∶1.5(生藥-藥液)，備用。

(2)乙肝寧水提液的醇沉處理 取上述乙肝寧水提濃縮液250 mL，稀釋至1∶2，加乙醇使含醇量為70%，4℃靜置過夜，抽濾，濃縮至100 mL，備用。

(3)乙肝寧水提液的絮凝澄清處理 取上述乙肝寧水提濃縮液250 mL，稀釋至1∶6，調(diào)pH值至6.00，恒溫至60℃，1300 r/min攪拌速度下緩慢加入1%殼聚糖溶液250 mL，繼續(xù)攪拌10 min，靜置過夜，離心并抽濾，濃縮至100 mL，備用。

2.2.2 乙肝寧水提液及其純化樣品液中2種氨基酸的測(cè)定

色譜條件 HypersilBDSC18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);流動(dòng)相 A為乙腈-水(4∶1)，流動(dòng)相B為0.1 mol/L醋酸鈉緩沖溶液(pH6.5)-乙腈 (97∶3)，梯度洗脫 (見表1);檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm;體積流量為1 mL/min;柱溫32 ℃;進(jìn)樣量5 μL。

氨基酸混合對(duì)照品溶液的制備 取精氨酸(Arg)、脯氨酸 (Pro)、賴氨酸 (Lys)各約0.1 g，精密稱定，分別置于10 mL量瓶中，重蒸水稀釋至刻度，搖勻，備用。精密量取上述精氨酸對(duì)照品溶液與脯氨酸對(duì)照品溶液各0.7mL、賴氨酸對(duì)照品溶液1 mL，置于25 mL量瓶中，重蒸水稀釋至刻度，搖勻，即得。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution program of mobile phase

樣品溶液的預(yù)處理 取上述經(jīng)兩種純化方法處理的乙肝寧樣品溶液，各調(diào)pH值至2.50，分別上732號(hào)陽(yáng)離子交換柱，靜態(tài)吸附2 h，蒸餾水洗滌至無(wú)糖 (α-萘酚濃硫酸Molish反應(yīng)為陰性)，2%氨水洗脫，收集茚三酮反應(yīng)為陽(yáng)性部分，濃縮，真空干燥至恒定質(zhì)量，研細(xì)，備用。另取250 mL乙肝寧水提液，濃縮至100 mL，同法進(jìn)行預(yù)處理。

柱前衍生化供試品溶液的制備 精密稱取上述預(yù)處理所得不同干膏粉各適量，分別置于10 mL量瓶中，重蒸水稀釋至刻度，搖勻。精密量取1.4 mL，置于5 mL量瓶中，重蒸水稀釋至刻度，搖勻。精密量取稀釋后溶液2 mL，置于10 mL PEG管中，加入1 mol/L三乙胺乙腈溶液和0.1 mol/L異硫氰酸苯酯乙腈溶液各1 mL，渦旋1 min，暗反應(yīng)1 h，加入4 mL正己烷萃取，渦漩1 min，靜置10 min，吸取下層溶液，過濾，即得。

柱前衍生化的對(duì)照品溶液與空白對(duì)照液的制備精密量取氨基酸混合對(duì)照品溶液適量，置于5 mL量瓶中，重蒸餾水稀釋至刻度，搖勻。精密量取稀釋液2 mL，照上述“柱前衍生化供試品溶液的制備”方法進(jìn)行處理，作為對(duì)照品溶液。另精密量取重蒸餾水2 mL，同法進(jìn)行處理，作為空白對(duì)照液。

系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 精密量取經(jīng)衍生化反應(yīng)后的混合對(duì)照品溶液、乙肝寧水提液供試品溶液及空白對(duì)照溶液各5 μL，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，3種氨基酸色譜峰分離良好，且空白對(duì)照未見干擾 (見圖2)。

線性關(guān)系考察 分別精密量取氨基酸混合對(duì)照品溶液5、4、2、1、0.5、0.25 mL于5 mL量瓶中，按上述“柱前衍生化供試品溶液的制備”方法進(jìn)行處理，每次進(jìn)樣5 μL，記錄峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)，對(duì)照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表2。

圖2 精氨酸、脯氨酸、賴氨酸的HPLC圖譜Fig.2 HPLC chromatograms of Arg，Pro，Lys

表2 3種氨基酸的線性關(guān)系Tab.2 Linear relationgship of three kinds of amino acids

精密度試驗(yàn) 精密吸取同一柱前衍生化供試品溶液5 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，結(jié)果Arg、Pro、Lys峰面積的RSD分別為0.68%、1.06%、2.50%。

穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一柱前衍生化供試品溶液 5 μL，分別于 0、2.5、5、10、15、24 h進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，計(jì)算 Arg、Pro、Lys峰面積的RSD分別為2.65%、1.92%、2.88%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

重復(fù)性試驗(yàn) 取上述乙肝寧水提液預(yù)處理所得干膏粉約0.08 g，共6份，精密稱定，依法測(cè)定3種氨基酸的量，計(jì)算Arg、Pro、Lys的RSD分別為2.87%、3.00%、2.68%。

加樣回收試驗(yàn) 取已知含量的乙肝寧復(fù)方水提液預(yù)處理所得干膏粉適量，共6份，精密稱定，分別精密加入精氨酸對(duì)照品溶液 (0.3546 mg/mL)1 mL，脯氨酸對(duì)照品溶液 (5.236 μg/mL)，賴氨酸對(duì)照品溶液 (0.03535 mg/mL)各0.5 mL，定容至5 mL，按上述“柱前衍生化供試品溶液的制備”方法進(jìn)行處理，依法測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果Arg、Pro、Lys的平均回收率分別為96.93%、97.99%、106.01%，RSD分別為1.79%、1.86%、2.52%。

樣品的測(cè)定 取乙肝寧水提液及其兩種純化溶液經(jīng)預(yù)處理后所得干膏粉適量，依法測(cè)定其精氨酸、脯氨酸、賴氨酸的量，并計(jì)算純化過程3種氨基酸的保留率，結(jié)果見表3～4。

表3 不同干膏樣品中3種氨基酸測(cè)定 (n=4，±s)Tab.3 Content of three kinds of amino acids in different dry extract samples(n=4，±s)

表3 不同干膏樣品中3種氨基酸測(cè)定 (n=4，±s)Tab.3 Content of three kinds of amino acids in different dry extract samples(n=4，±s)

)干膏樣品來(lái)源 氨基酸/(mg·g－1精氨酸 脯氨酸 賴氨酸乙肝寧水提液59.2±3.2 0.438±0.033 2.98±0.20醇沉純化液 11.9±0.7 0.793±0.010 1.08±0.04絮凝澄清純化液63.2±0.2 0.442±0.006 3.49±0.22

表4 不同藥液樣品中3種氨基酸量及其保留率Tab.4 Content and retention rates of three kinds of amino acids in different liquid medicine samples

3 小結(jié)和討論

目前，測(cè)定中藥材中氨基酸的方法主要有氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定法、蒸發(fā)光散射-高效液相色譜法 (ELSD-HPLC)、柱前衍生高效液相法等［11］。氨基酸自動(dòng)分析儀、ELSD-HPLC均具有操作簡(jiǎn)單、分析時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，但前者價(jià)格昂貴，而后者靈敏度低，作者在預(yù)實(shí)驗(yàn)中曾嘗試此法，較難測(cè)定樣品中游離氨基酸的量，故選用靈敏度高的柱前衍生高效液相法。PITC柱前衍生法采用常規(guī)C18柱、UV檢測(cè)器就可檢測(cè)一、二級(jí)氨基酸，且產(chǎn)物穩(wěn)定，因而本實(shí)驗(yàn)選用PITC作為衍生化試劑。

在色譜條件摸索中，對(duì)柱溫和進(jìn)樣量進(jìn)行考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩者對(duì)分離效果影響較大。當(dāng)柱溫過高或過低時(shí)，分離度均會(huì)降低，這可能是氨基酸性質(zhì)相似，在一定溫度范圍內(nèi)，它們洗脫速度接近，難分開;當(dāng)進(jìn)樣量10 μL時(shí)，精氨酸、賴氨酸前沿峰顯著，改為5 μL后，峰形得到顯著改善，分析原因可能是進(jìn)樣溶液中含有約50%的乙腈，與初始流動(dòng)相溶劑體系存在較大差距，進(jìn)樣體積越大影響越大，引起前沿峰。

20種常見氨基酸中只有精氨酸、脯氨酸、賴氨酸有吸濕性，且后兩者吸濕性強(qiáng)于糖類。因此，本實(shí)驗(yàn)以上述3種氨基酸為指標(biāo)，比較了兩種純化方法對(duì)乙肝寧復(fù)方水提液中氨基酸的影響。結(jié)果表明，殼聚糖絮凝澄清法對(duì)乙肝寧復(fù)方水提液中精氨酸、賴氨酸的保留明顯優(yōu)于醇沉法;而對(duì)于脯氨酸的保留，雖不如醇沉法，但仍有較高的保留率。此現(xiàn)象可能是由于精氨酸和賴氨酸的水溶性強(qiáng) (極性大)、醇溶性小，而脯氨酸屬一種非極性氨基酸，具有相對(duì)大的醇溶性所致。這與前期研究結(jié)果(殼聚糖絮凝澄清法對(duì)中藥水提液中極性大的水溶性成分的保留優(yōu)于醇沉法，而對(duì)低極性的親脂性成分的保留則不如醇沉法)一致［3］。另外，由于3種氨基酸pKa較高，在弱酸性的中藥水提液中大部分以陽(yáng)離子形式存在，而根據(jù)殼聚糖絮凝澄清法原理［12］，殼聚糖本身帶有正電荷，同性相斥，故殼聚糖絮凝澄清法對(duì)水提液中的氨基酸的保留總體較高。據(jù)此，可認(rèn)為殼聚糖絮凝澄清法相對(duì)于醇沉法可降低中藥浸膏的吸濕性，不是通過影響氨基酸量的途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)的。李靜對(duì)乙肝寧復(fù)方中糖類吸濕性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)糖類是影響乙肝寧吸濕性的重要因素之一，說明吸濕性降低機(jī)制可能與保留吸濕性弱的多糖相關(guān)［13］。

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