唐慧勤，馮 旭，閻 莉，衛(wèi)智權(quán)

(廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西南寧 530001)

亮葉楊桐系山茶科楊桐屬植物亮葉楊桐Adinandra nitida Merr.ex Li的干燥葉［1］，主要生長(zhǎng)在陰冷潮濕的懸崖峭壁或溝谷溪澗邊，在我國(guó)的黔、桂、云、川等省均有分布，尤以平樂縣產(chǎn)量最多［2-3］。該植物具有消炎解毒、降壓、退熱和止血等作用，民間用于防治各種炎癥、無(wú)名腫毒及外傷等［4］。而現(xiàn)代研究表明，它還有抗腫瘤、抑制癌基因、抗氧化和抑菌等功效［5-7］。其主要成分黃酮類的量為20%左右，是目前發(fā)現(xiàn)在自然植物中含黃酮類量最高的植物之一［8-9］。本研究通過(guò)建立高脂血癥大鼠模型，觀察亮葉楊桐總黃酮對(duì)高脂血癥大鼠的脂質(zhì)代謝的影響和抗氧化作用。

1 材料

1.1 藥物 亮葉楊桐購(gòu)自廣西平樂縣供銷社，廣西中醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院中藥鑒定教研室廖月葵高級(jí)實(shí)驗(yàn)師鑒定為山茶科楊桐屬植物亮葉楊桐Adinandra nitida Merr.ex Li的干燥葉。血脂康膠囊:北大維信生物科技有限公司，批號(hào)20050507。

1.2 動(dòng)物 健康SD大鼠，體質(zhì)量約200～220 g，雄性，由廣西壯族自治區(qū)藥品檢驗(yàn)研究所提供［SPF級(jí)動(dòng)物，動(dòng)物許可證號(hào):SCXK桂2003-0001］。

1.3 試劑 膽固醇，上海伯奧生物有限公司，批號(hào) 050705;膽鹽，杭州微生物試劑有限公司，批號(hào):20 050516;總膽固醇(TC)試劑盒，德國(guó)奧林巴斯(Olympus)公司，批號(hào)2575;甘油三酯(TG)試劑盒德國(guó)奧林巴斯(Olympus)公司，批號(hào)3112;高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)試劑盒，德國(guó)奧林巴斯(Olympus)公司，批號(hào)3659;谷草轉(zhuǎn)氨酶AST試劑盒，德國(guó)奧林巴斯(Olympus)公司，批號(hào)1937;谷丙轉(zhuǎn)氨酶ALT試劑盒，德國(guó)奧林巴斯(Olympus)公司，批號(hào)2751;低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)試劑盒，中北北控生物科技股份有限公司產(chǎn)品，批號(hào) 242021;超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒，南京建成生物工程研究所，批號(hào)20 051013;丙二醛(MDA)試劑盒，南京建成生物工程研究所，批號(hào)20 051006;蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，中國(guó)藥品生物制品檢驗(yàn)，批號(hào)0080-9303。

1.4 儀器 TU-1901型紫外分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)、L600臺(tái)式低速自動(dòng)平衡離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司)、EL204電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)、AU400全自動(dòng)生化分析儀(德國(guó)Olympus)、LG-R-80B型血液黏度儀和血小板聚集凝血因子分析儀(北京中勤世帝科學(xué)儀器有限公司)。

2 方法

2.1 藥物樣品制備［5］取1000 g亮葉楊桐，粉碎過(guò)20目篩，用8倍70%乙醇在70℃下浸提4 h，共3次，合并提取液并過(guò)濾，回收溶劑，水相用石油醚脫酯，再用乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯萃取液，減壓回收溶劑，得黃綠色粉末，即亮葉楊桐總黃酮樣品。

2.2 亮葉楊桐總黃酮的測(cè)定 準(zhǔn)確稱取于120℃干燥至恒定質(zhì)量的蘆丁對(duì)照品15.20 mg，用甲醇溶解并稀釋至刻度。準(zhǔn)確量取此液 1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL于25 mL量瓶中，分別加5%NaNO20.1 mL，放置6 min，加10%Al(NO3)3溶液1.0 mL，放置6 min。再加10%NaOH 10 mL，用蒸餾水稀釋至刻度，混勻，放置15 min。在510 nm處測(cè)定溶液吸光度(A)，得出總黃酮質(zhì)量濃度(C)吸光度(A)回歸方程:A=11.289C－0.09511，相關(guān)系數(shù)R=0.9997。由標(biāo)準(zhǔn)曲線可知在0.02403～0.07296 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。將亮葉楊桐總黃酮樣品稀釋一定質(zhì)量濃度，精密吸取1.0 mL于25 mL量瓶中，同上法處理后測(cè)定溶液吸光度，將吸光度值代入回歸方程計(jì)算得總黃酮的質(zhì)量濃度，并計(jì)算亮葉楊桐總黃酮樣品中總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為71.3%。

2.3 模型制備［10］取 SD大鼠 60只，體質(zhì)量200～220 g，雄性，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周，按體質(zhì)量隨機(jī)分成6組，每組10只，即正常組、模型組、血脂康對(duì)照組、亮葉楊桐總黃酮高、中、低劑量組。除正常組每日給予普通飼料喂養(yǎng)，其余各組每日給予高脂飼料(基礎(chǔ)飼料87%、膽固醇2%、膽鹽1%、豬油10%)，連續(xù)喂養(yǎng)5周。5周后，大鼠禁食不禁水10 h，隨機(jī)抽取每組5只大鼠，共30只，斷尾取血，測(cè)TC、TG，確定造模是否成功。

2.4 給藥 造模成功后，于次日給藥。正常組和模型組給藥等量蒸餾水，血脂康對(duì)照組劑量為300 mg/kg，亮葉楊桐總黃酮低、中、高劑量組分別為200、400、600 mg/kg，各組均按1 mL/100 g體質(zhì)量ig給藥，每日1次，連續(xù)35 d。每3天稱定質(zhì)量1次，根據(jù)體質(zhì)量調(diào)整給藥量。用藥期間正常組飼以普通飼料，模型組和各給藥組每只大鼠仍給與高脂飼料以維持模型，自由飲水。

2.5 標(biāo)本采集 治療35 d后，禁食(不禁水)12 h，末次給藥1 h后，10%烏拉坦1 mL/100 g腹腔注射麻醉，取腹主動(dòng)脈血6 mL，其中3 mL血待自然凝固后，3000 r/min，離心10 min，分離血清，用于測(cè)定血清 TC、TG、HDL-C、LDL-C、MDA、SOD、ALT、AST。另外1 mL用肝素鈉40 U/mL抗凝用于測(cè)定全血黏度，2 mL用枸櫞酸鈉抗凝用于血小板聚集的測(cè)定。同一位置取肝組織用異丙醇提取，測(cè)定肝臟TC、TG。

2.6 血清、肝臟脂質(zhì)和生化指標(biāo)的測(cè)定 取血清在全自動(dòng)生化分析儀上按試劑盒要求測(cè)定TC(酶法)、TG(酶法)、HDL-C(酶法)、LDL-C(清除法)、MDA(TBA法)、SOD(黃嘌呤氧化法)、ALT(IFCC法)、AST(IFCC法)。

2.7 全血黏度的測(cè)定 取1 mL血液，按40 U/mL肝素抗凝，加到血液流變儀測(cè)定全血低切、中切、高切黏度。

2.8 比濁法測(cè)定血小板聚集性 取血2 mL，500 r/min離心10 min，制備富血小板血漿(PRP);再以3000 r/min離心10 min，制備貧血小板血漿(PPP)。調(diào)節(jié)PRP中血小板密度約在200×109L－1，以終濃度5μmol/L的ADP為血小板聚集誘導(dǎo)劑，采用比濁法于37℃測(cè)定血小板最大聚集率。

2.9 統(tǒng)計(jì)方法 用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件統(tǒng)計(jì)，組間比較用單因素方差分析，結(jié)果以表示。P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 亮葉楊桐總黃酮對(duì)高脂血癥大鼠血清中脂質(zhì)水平的影響 模型組血清TC、TG及LDL-C均明顯升高，HDL-C明顯降低(與正常組比，P＜0.05)，說(shuō)明高脂血癥大鼠模型成功。用亮葉楊桐總黃酮治療后，低、中、高劑量組血清TC、TG、LDL-C水平均明顯降低(P＜0.05)，HDL-C水平明顯升高。血脂康組亦可降低血清TC、TG及LDL-C(P＜0.05)，但對(duì)HDL-C無(wú)影響。結(jié)果見表1。

表1 亮葉楊桐總黃酮對(duì)高脂血癥大鼠血清中脂質(zhì)水平的影響(，n=10)Tab.1 Effect of total flavonoids from Adinandra nitida on serum lipid levels in hyperlipidemic rats(，n=10)

表1 亮葉楊桐總黃酮對(duì)高脂血癥大鼠血清中脂質(zhì)水平的影響(，n=10)Tab.1 Effect of total flavonoids from Adinandra nitida on serum lipid levels in hyperlipidemic rats(，n=10)

注:與正常組比較，*P＜0.05;與模型組比較，△P＜0.05。表2～4同。

LDL-C/(mmol·L－1)正常組 － 0.74±0.09 1.39±0.24 1.09±0.20 0.33±0.06模型組 － 1.39±0.45* 3.48±0.78* 0.81±0.12* 1.35±0.32*血脂康組 300 1.05±0.08△ 2.10±0.21△ 0.81±0.12 0.75±0.08△亮葉楊桐總黃酮低劑量組 200 1.01±0.14△ 2.96±0.98 0.95±0.13△ 1.13±0.28亮葉楊桐總黃酮中劑量組 400 0.98±0.22△ 2.76±0.54△ 0.94±0.15△ 1.11±0.27亮葉楊桐總黃酮高劑量組 600 0.85±0.19△ 2.59±0.61△ 0.81±0.08 0.98±0.27組 別 劑量/(mg·kg－1)TC/(mmol·L －1)TG/(mmol·L －1)HDL-C/(mmol·L －1)△

3.2 亮葉楊桐總黃酮對(duì)高脂血癥大鼠血清SOD、MDA、AST和ALT的影響 模型組大鼠與正常對(duì)照組比較，血清中 SOD顯著下降(P＜0.05)，MDA顯著上升(P＜0.05)，提示模型組大鼠抗氧化能力下降，脂質(zhì)過(guò)氧化物生成增多;而AST、ALT明顯升高(P＜0.05)，表明肝功能受到損傷。亮葉楊桐總黃酮低劑量可顯著升高血清中SOD水平(P＜0.05)，各劑量組均可顯著降低血清中MDA水平(P＜0.05)。而血脂康組SOD和MDA與模型組比無(wú)統(tǒng)計(jì)意義。結(jié)果顯示，亮葉楊桐總黃酮的抗氧化能力較強(qiáng)。此外，亮葉楊桐總黃酮低、中、高劑量組均可降低其肝臟 TC、TG和血清AST、ALT水平(P＜0.05)。血脂康組亦可減低肝臟TC、TG及血清AST、ALT水平(P＜0.05)，亮葉楊桐總黃酮作用與其相似。結(jié)果見表2。

表2 亮葉楊桐總黃酮對(duì)高脂血癥大鼠血清SOD、MDA、AST和ALT的影響(，n=10)Tab.2 Effect of total flavonoids from Adinandra nitida on serum SOD，MDA，AST and ALT in hyperlipidemic rats(，n=10)

表2 亮葉楊桐總黃酮對(duì)高脂血癥大鼠血清SOD、MDA、AST和ALT的影響(，n=10)Tab.2 Effect of total flavonoids from Adinandra nitida on serum SOD，MDA，AST and ALT in hyperlipidemic rats(，n=10)

ALT/(U·L －1)正常組 － 425.46±14.69 4.01±0.76 255.71±43.60 65.15±12.68模型組 － 404.60±16.16* 6.80±2.56* 332.69±43.46* 109.77±13.62*血脂康組 300 426.26±47.94 5.13±1.86 260.59±35.79△ 70.03±8.41△亮葉楊桐總黃酮低劑量組 200 440.21±18.58△ 4.76±1.90△ 315.99±32.69 81.52±9.10△亮葉楊桐總黃酮中劑量組 400 411.16±34.32 3.86±1.03△ 265.05±62.71△ 82.02±15.39△亮葉楊桐總黃酮高劑量組 600 397.35±22.04 4.24±0.79△ 235.14±54.14△ 71.40±5.09組 別 劑量/(mg·kg －1)SOD/(U·L －1)MDA/(mmol·L －1)AST/(U·L －1)△

3.3 亮葉楊桐總黃酮對(duì)高脂血癥大鼠肝臟中TC、TG的影響 模型組大鼠肝臟中TC、TG明顯升高，與正常對(duì)照組比較有顯著意義(P＜0.05)，提示大鼠肝臟可能發(fā)生了脂肪變性。亮葉楊桐總黃酮低、中、高劑量組可降低其肝臟TC、TG(P＜0.05)。血脂康組亦可減低肝臟 TC、TG(P＜0.05)，亮葉楊桐總黃酮作用與其相似甚至稍強(qiáng)。結(jié)果見表3。

3.4 亮葉楊桐總黃酮對(duì)高脂血癥大鼠全血黏度和血小板聚集率的影響 模型組大鼠與正常對(duì)照組比較，血小板聚集率增加(P＜0.05)，低、中切全血黏度顯著上升(P＜0.05)，高切全血黏度無(wú)顯著意義，提示高脂血癥大鼠血流變學(xué)發(fā)生了變化。亮葉楊桐總黃酮低、高劑量能顯著抑制血小板聚集率(P＜0.05);亮葉楊桐總黃酮中、高劑量能降低大鼠低切全血黏度(P＜0.05)，高劑量降低中切全血黏度(P＜0.05)，但對(duì)高切全血黏度均無(wú)影響。血脂康僅降低血小板聚集率(P＜0.05)，對(duì)全血黏度均無(wú)影響。結(jié)果見表4。

表3 亮葉楊桐總黃酮對(duì)高脂血癥大鼠肝臟中TC、TG的影響(，n=10)Tab.3 Effect of total flavonoids from Adinandra nitida on liver TC，TG in hyperlipidemic rats(，n=10)

表3 亮葉楊桐總黃酮對(duì)高脂血癥大鼠肝臟中TC、TG的影響(，n=10)Tab.3 Effect of total flavonoids from Adinandra nitida on liver TC，TG in hyperlipidemic rats(，n=10)

TG/(mmol·L －1)正常組 － 1.49±0.70 2.80±0.73模型組 － 5.87±0.92* 6.94±1.06*血脂康組 300 4.28±0.72△ 5.78±0.12△亮葉楊桐總黃酮低劑量組 200 4.07±0.66△ 4.92±1.11△亮葉楊桐總黃酮中劑量組 400 4.90±0.48△ 5.76±0.81△亮葉楊桐總黃酮高劑量組 600 5.40±0.72 5.37±1.45組 別 劑量/(mg·kg－1)TC/(mmol·L －1)△

表4 亮葉楊桐總黃酮對(duì)高脂血癥大鼠全血黏度和血小板聚集率的影響(，n=10)Tab.4 Effect of total flavonoids from Adinandra nitida on blood viscosity and platelet maximum aggregation rate in hyperlipidemic rats(，n=10)

表4 亮葉楊桐總黃酮對(duì)高脂血癥大鼠全血黏度和血小板聚集率的影響(，n=10)Tab.4 Effect of total flavonoids from Adinandra nitida on blood viscosity and platelet maximum aggregation rate in hyperlipidemic rats(，n=10)

組 別 劑量/(mg·kg－1)全血黏度低切/(mPa·s) 中切/(mPa·s) 高切/(mPa·s) 血小板聚集率/%正常組 － 4.60±0.59 3.04±0.18 2.71±0.19 48.07±8.27模型組 － 5.80±0.41* 3.25±0.16* 2.73±0.13 60.41±5.87*血脂康組 300 5.60±0.76 3.17±0.21 2.75±0.13 53.32±5.23△亮葉楊桐總黃酮低劑量組 200 5.75±0.64 3.32±0.19 2.92±0.19 47.02±6.47△亮葉楊桐總黃酮中劑量組 400 5.26±0.42△ 3.14±0.19 2.76±0.10 54.95±8.03亮葉楊桐總黃酮高劑量組 600 4.79±0.53△ 3.06±0.25△ 2.74±0.24 51.87±6.47△

4 討論

動(dòng)脈粥樣硬化是缺血性腦血管病的主要病理基礎(chǔ)，而脂質(zhì)代謝異常是動(dòng)脈粥樣硬化形成的重要因素［11-13］?，F(xiàn)已知血清TC、TG和 LDL-C水平與動(dòng)脈粥樣硬化呈正相關(guān)，HDL-C水平與動(dòng)脈粥樣硬化呈負(fù)相關(guān)。高脂血癥可引起血液流變學(xué)的異常，導(dǎo)致全血黏度增加，紅細(xì)胞變形能力下降，造成微循環(huán)障礙。在動(dòng)脈粥樣硬化形成的過(guò)程中伴有脂質(zhì)過(guò)氧化損傷，血液和組織細(xì)胞中MDA水平增多，也使血小板膜損傷并聚集變形釋放出氧自由基，造成對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)一步損傷和平滑肌細(xì)胞增殖。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明亮葉楊桐總黃酮可顯著降低高脂血癥大鼠血清TC、TG、LDL-C水平，提高HDLC水平，說(shuō)明其可通過(guò)直接清除血清中脂質(zhì)，增加脂質(zhì)的逆轉(zhuǎn)運(yùn)，發(fā)揮調(diào)節(jié)血脂代謝的作用;抑制TC、TG在肝臟中的聚集，減少血清中AST、ALT水平，發(fā)揮抗脂肪肝和保護(hù)肝功能的作用;顯著提高血清中SOD活性，抑制MDA產(chǎn)生，提高機(jī)體的抗氧化能力;對(duì)二磷酸腺苷(ADP)誘導(dǎo)的血小板聚集有抑制作用;直接降低全血黏度，尤其是低切血液黏度，同時(shí)它也可以間接通過(guò)降低血清TC、TG，升高HDL-C，增加紅細(xì)胞膜流動(dòng)性，改善高脂血癥大鼠血液流變學(xué)而起到調(diào)節(jié)脂質(zhì)作用，抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。

亮葉楊桐富含生物活性成分，具有較高營(yíng)養(yǎng)保健和藥用價(jià)值，開發(fā)應(yīng)用的潛力很大。本研究為亮葉楊桐進(jìn)一步開發(fā)打下基礎(chǔ)，有較高的參考價(jià)值。

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