沈 熊， 梁 健， 黃廼奇， 楊春欣， 呂遷洲

(復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院藥劑科，上海200032)

黃芩素 (Baicalein)異名:黃芩苷元，黃芩黃素，為唇形科Labiatae黃芩屬Scutellaria多年生草本中藥植物黃芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根中提取的黃酮類化合物，是黃芩的最主要活性成分之一，具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗纖維化及心腦血管、神經(jīng)元保護(hù)等藥理作用，提示黃芩素具有多層次、多途徑、多靶點(diǎn)的藥理活性作用［1］。黃芩素在胃和小腸中吸收良好，在結(jié)腸中有少量吸收，提示適宜制成緩控釋制劑［2，3］。微丸作為多單元?jiǎng)┬?，具有受生理因素影響小、胃腸道分布廣、釋藥變異小等優(yōu)點(diǎn)，因此是緩控釋和靶向制劑的優(yōu)良劑型［4］。

Eudragit RS與Eudragit RL屬于水不溶性成膜材料，在水中可溶脹，Eudragit RS比Eudragit RL滲透性和溶脹性小，將二者配合使用，可有效調(diào)節(jié)包衣型緩釋制劑的釋藥速率［5］。本研究應(yīng)用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)法優(yōu)選出釋放效果理想的緩釋包衣處方，并檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷念A(yù)測(cè)性。

1 材料與儀器

黃芩素原料 (陜西慈緣生物技術(shù)有限公司)，黃芩素對(duì)照 (中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)1115952200604);微晶纖維素丸芯 (Celphere 507，日本旭化成公司);Eudragit RS 30D與Eudragit RL 30D(上海羅姆公司藥用樹脂部);聚乙烯吡咯烷酮 (PVP K29/32，國際特品公司);羥丙甲纖維素 (HPMC，6cps，上?？房蛋录夹g(shù)有限公司);檸檬酸三乙酯 (TEC，美國Morflex公司)，甲醇、乙腈為色譜純，其它試劑均為分析純。

氣流粉碎機(jī) (JGM-H50型，華東理工大學(xué))，流化床包衣機(jī) (GPCG 1，Glatt，德國);智能溶出儀 (ZRS-4型，天津大學(xué)無線電廠);Agilent 1200高效液相色譜系統(tǒng) (美國)。

2 方法和結(jié)果

2.1 黃芩素緩釋微丸的制備

2.1.1 載藥微丸的制備 用氣流粉碎機(jī)對(duì)原料藥物進(jìn)行微粉化。以25%PVP水溶液為黏合劑，攪拌下將微粉化的黃芩素 (粒徑2～10 μm)分散于其中制成混懸液。將空白丸芯至于包衣機(jī)中，采用底噴法，丸芯在流化狀態(tài)下預(yù)熱5 min，工藝條件見表1，包衣過程中需對(duì)包衣液持續(xù)攪拌。包衣完成后，再包一層HPMC層作為隔離層，增加質(zhì)量2%。

表1 黃芩素載藥微丸和緩釋微丸制備工藝參數(shù)Tab.1 Process parameters for baicalein layering and the sustained release coating of layered pellets

2.1.2 緩釋微丸的制備 分別稱取Eudragit RS 30D與Eudragit RL 30D兩種水分散體，按預(yù)定比例混合，加水適量，攪勻。將滑石粉、檸檬酸三乙酯和消泡劑 (甲基硅油)加入適量水中，混勻。將此混懸液緩慢倒入上述水分散體中，攪勻，過80目篩，即得緩釋包衣液。取黃芩素載藥微丸適量至于包衣機(jī)中，采用底噴法，按表1工藝參數(shù)制備，包衣結(jié)束后同樣包一HPMC隔離層。

2.2 黃芩素緩釋微丸含量測(cè)定方法

2.2.1 色譜條件 Phenomenex Luna C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為0.05%三氟乙酸-乙腈-甲醇 (55∶20∶25);體積流量 1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)272 nm;柱溫30℃，進(jìn)樣量20 μL。

2.2.2 測(cè)定方法 取黃芩素對(duì)照品適量，精密稱定，加流動(dòng)相制成每1 mL含500 μg的溶液，作為對(duì)照品溶液。取黃芩素微丸適量，研細(xì)，精密稱取細(xì)粉500 mg(約相當(dāng)于黃芩素5 mg)，置10 mL量瓶中，加流動(dòng)相9 mL，超聲處理30 min，加流動(dòng)相稀釋至刻度，混勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，作為供試品溶液。

取對(duì)照品溶液和供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)下操作，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算。

2.3 黃芩素緩釋微丸體外釋放度測(cè)定

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密吸取上述對(duì)照品溶液2、10、20、30、40 μL進(jìn)樣，按上述色譜條件測(cè)定其峰面積值。以峰面積值X對(duì)進(jìn)樣量Y(μg)進(jìn)行回歸，得回歸方程為Y=64696X+5689，r=0.9999(n=5)，表明黃芩素進(jìn)樣量在1.00～20.00 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.3.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液20 μL，于同日內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，黃芩素的RSD為0.82%(n=6)。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液分別于0、2、4、6、8、12 h進(jìn)樣20 μL，記錄峰面積，黃芩素的RSD為2.83%，表明處理后的樣品溶液室溫放置12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好，符合實(shí)驗(yàn)測(cè)試要求。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取微丸 (批號(hào)120117)研勻，精密稱取6份，每份約500 mg，按2.2.2項(xiàng)下方法制備，再按2.2.1項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定，黃芩素的RSD為1.60%。

2.3.5 加樣回收率 精密稱取2.3.4項(xiàng)下已測(cè)定含量的微丸6份，每份約500 mg，精密加入對(duì)照品適量，按2.2.2項(xiàng)下方法制備，再按2.2.1項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定，黃芩素的平均回收率為98.21%，RSD為1.92%。

2.3.6 體外釋放度測(cè)定 根據(jù)中國藥典2010年版二部附錄X D第一法，采用溶出度測(cè)定法 (附錄X C)第一法的裝置，稱取黃芩素微丸適量 (含黃芩素約10 mg)，以脫氣的新鮮純化水900 mL為介質(zhì)，溫度為 (37±0.5)℃，轉(zhuǎn)速為75 r/min，依法操作，分別于2、6、12 h取樣5 mL，同時(shí)補(bǔ)充(37±5)℃同體積的釋放介質(zhì)，樣品經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，測(cè)定含量，計(jì)算累積釋放度。

2.4 Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化緩釋微丸處方

2.4.1 Box-Behnken設(shè)計(jì) 在單因素考察的基礎(chǔ)上，選取對(duì)緩釋微丸系統(tǒng)釋藥影響較明顯的3個(gè)因素，即增塑劑 (TEC)在包衣液中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)、聚合物比例 (Eudragit RS 30D:Eudrgit RL 30D)以及包衣增重，分別記為X1、X2和X3，在3個(gè)水平上進(jìn)行了優(yōu)化研究，以2、6、12 h的釋放度為響應(yīng)值，分別記為Y1、Y2和Y3，建立數(shù)學(xué)模型，優(yōu)化黃芩素緩釋微丸處方。試驗(yàn)中每個(gè)因素的3水平分別記作-1、0、+1，見表2，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3。

表2 Box-Behnken設(shè)計(jì)的因素和水平Tab.2 Independent variables:factors and their levels for Box-Behnken design

表3 Box-Behnken設(shè)計(jì)及響應(yīng)值Tab.3 Experimental runs and observed values of responses for Box-Behnken design

其中，Adj.R2為校正后的決定系數(shù) (Adjusted R-Squared)，結(jié)果表明，緩釋微丸在2、6、12 h的釋放度與增塑劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)、聚合物比例、以及包衣增重三因素各水平的非線性擬合效果較好，相關(guān)系數(shù)較大 (Adj.R2＞0.94)。

2.4.3 處方優(yōu)化和預(yù)測(cè) 應(yīng)用Design Expert 7.0進(jìn)行擬合作圖，得響應(yīng)面圖和等高線圖，可直觀反應(yīng)各因素和響應(yīng)值、以及各因素之間的交互作用，以響應(yīng)值Y2為例，列舉了各因素和響應(yīng)值的三維圖。

為了確定黃芩素緩釋微丸優(yōu)化模型的取值區(qū)域，根據(jù)緩釋制劑指導(dǎo)原則，對(duì)3個(gè)取樣點(diǎn)的釋放度分別設(shè)定目標(biāo)范圍，其中2 h為10%～30%，考察藥物是否有突釋;6 h為40%～60%，用于確定釋藥特性;12 h為90%以上，用于考察釋藥是否基本完全，此3點(diǎn)可用于表證體外緩釋制劑藥物釋放度［6］。經(jīng)Design Expert7.0軟件計(jì)算，得到最優(yōu)處方為:X1為11%，X2為4%，X3為12%，響應(yīng)值的預(yù)測(cè)值分別為:Y1為28.34%，Y2為58.56%，Y3為95.00%。

2.4.4 驗(yàn)證性試驗(yàn) 根據(jù)上述最優(yōu)處方組成，增塑劑檸檬酸三乙酯在包衣液中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為11%，聚合物比例 (Eudragit RS∶Eudragit RL)為4∶1，包衣增重為11%，按表1工藝參數(shù)制備3批黃芩素緩釋微丸，考察釋放度，得3個(gè)指標(biāo)的實(shí)測(cè)值，將實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值比較，根據(jù)以下公式計(jì)算偏差:偏差=(實(shí)測(cè)值-預(yù)測(cè)值)/預(yù)測(cè)值×100%，偏差越小，表明所建立的模型預(yù)測(cè)性越好。結(jié)果見表4。結(jié)果顯示制得微丸的釋放度實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值基本一致，說明所建立的擬合模型具有較高的可靠性，預(yù)測(cè)性良好。

各因素與響應(yīng)值 (Y2)的三維圖見圖1。

2.4.2 Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果運(yùn)用Design Expert 7.0，經(jīng)多元線性及非線性回歸處理并適當(dāng)簡(jiǎn)化，得擬合方程:

表4 預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值的偏差Tab.4 Bias between predicted and observed values

3 討論

圖1 各因素與響應(yīng)值 (Y2)的三維圖Fig.1 Three-dimensional response surface plot showing effect of independent factor Y2 on response values

本實(shí)驗(yàn)制備的黃芩素緩釋微丸，體外釋放度主要取決于包衣液中增塑劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)、包衣液中聚合物比例、以及包衣增重。通過Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面優(yōu)化，得到最優(yōu)處方，制得包衣微丸可以達(dá)到緩釋的目的。根據(jù)參考文獻(xiàn)［7，8］，采用高效液相色譜法測(cè)定緩釋微丸中黃芩素的量和釋放度，方法準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、重現(xiàn)性好。

Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)法是響應(yīng)面設(shè)計(jì)法的一種，它可以提供多因素、三水平的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及分析，目前已被廣泛的應(yīng)用于中藥提?。?］和藥物制劑處方篩選和優(yōu)化［10，11］等藥學(xué)研究領(lǐng)域。

評(píng)價(jià)模型擬合度時(shí)，向模型中增加沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變量，決定系數(shù)R2值仍會(huì)增大，校正后的決定系數(shù) (Adj.R2)克服了自變量個(gè)數(shù)的影響，當(dāng)模型中增加的變量沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)，校正決定系數(shù)會(huì)減小，計(jì)算公式如下:

其中，n為觀測(cè)值個(gè)數(shù)，p為解釋變量個(gè)數(shù)，Adj.R2越大，模型擬合越好［12］。

為簡(jiǎn)化方程求解，在保證擬合度的前提下，進(jìn)行了相應(yīng)的方程簡(jiǎn)化。以響應(yīng)值Y1為例，擬合得到完整的二次多項(xiàng)式為:Y1=116.02-3.05X1-9.47X2-4.00X3+0.06X1X2+0.01X1X3+0.13X2X3+0.05X12+0.48X22+0.06X32，P ＜ 0.0001。根據(jù)方差分析結(jié)果，除X1X2項(xiàng)和X1X3項(xiàng)外，其余各項(xiàng)均為顯著項(xiàng) (P＜0.05)或以上，本實(shí)驗(yàn)在置信度P=0.05水平上簡(jiǎn)化方程，舍去P＞0.05的項(xiàng)，得到簡(jiǎn)化的擬合方程為 Y1=107.13-2.60X1-8.34X2-3.74X3+0.13X2X3+0.05X12+0.48X22+0.06X32，R2=0.9896，P ＜0.05，同理簡(jiǎn)化了Y2和Y3兩個(gè)響應(yīng)值的擬合方程，并驗(yàn)證簡(jiǎn)化模型的預(yù)測(cè)性，結(jié)果顯示預(yù)測(cè)準(zhǔn)確可靠。上述結(jié)果顯示，Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法具有良好的預(yù)測(cè)性，可有效應(yīng)用于黃芩素緩釋微丸的處方篩選和優(yōu)化。

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