劉 芳 黃靜敏 何永盛 李傳禮

（深圳市計(jì)量質(zhì)量檢測(cè)研究院 廣東深圳 518131）

1 前言

分子生物學(xué)技術(shù), 特別是PCR 作為一種簡(jiǎn)便高效的核酸擴(kuò)增技術(shù)，在食品和衛(wèi)生安全檢測(cè)方面發(fā)揮著重大作用。但PCR 方法操作過程須通過電泳才能觀察到實(shí)驗(yàn)結(jié)果，不適用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)制約了現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)及基層實(shí)驗(yàn)室普及應(yīng)用。因此，開發(fā)一種簡(jiǎn)易快捷、特異靈敏的核酸擴(kuò)增檢測(cè)方法成為當(dāng)務(wù)之急。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Loop-mediated isothermal amplification, 簡(jiǎn)稱LAMP) 技術(shù)是Notomi等[1]首先提出來的, 它依賴于4條特異性引物和一種具有鏈置換活性的DNA 聚合酶(Bst DNA聚合酶)，在等溫條件下可高效、快速、特異地?cái)U(kuò)增靶序列。以其特異性強(qiáng)、靈敏度高、快速準(zhǔn)確和操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)在核酸的科學(xué)研究、疾病的診斷和預(yù)防、動(dòng)物胚胎的性別鑒定和轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)等領(lǐng)域得到了日益廣泛的應(yīng)用。與PCR 相比，LAMP 反應(yīng)在一般恒溫條件下進(jìn)行，所需設(shè)備簡(jiǎn)易、成本相對(duì)低廉，同時(shí)又能滿足快速檢測(cè)的需要，所以更具推廣性，特別適用于基層單位及現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，有望成為一種簡(jiǎn)易的常規(guī)檢測(cè)手段，具有廣闊的應(yīng)用前景。

2 LAMP技術(shù)反應(yīng)原理

LAMP技術(shù)是在恒溫的條件下敏感、高效、特異的擴(kuò)增靶基因核酸序列，可分成起始階段、環(huán)擴(kuò)增階段和延伸階段。主要利用2條內(nèi)引物(FIP，BIP) 和2條外引物(F3，B3)特異性識(shí)別靶基因上的6 個(gè)特定區(qū)域，和具有鏈置換活性的DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)進(jìn)行擴(kuò)增（圖 1）。LAMP具有很高的專一性，因?yàn)橹挥挟?dāng)引物和靶基因上6個(gè)特殊區(qū)域都發(fā)生配對(duì)時(shí)才能進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。通過添加反轉(zhuǎn)錄酶還可進(jìn)行RNA序列的擴(kuò)增（PTLAMP）。PCR已作為分子生物學(xué)一種基本工具，如分子克隆，而LAMP具有的多種特性可快速簡(jiǎn)便地檢測(cè)樣品的核酸序列。而且通過以下幾方面的優(yōu)化，使LAMP成為快速簡(jiǎn)便的診斷工具。

2.1 添加環(huán)引物

在LAMP法的基礎(chǔ)上，在啞鈴狀結(jié)構(gòu)的5’末端的環(huán)狀單鏈部分導(dǎo)入具有互補(bǔ)序列的環(huán)引物（LB和LF）,能夠增加DNA合成的起點(diǎn)，可縮短擴(kuò)增時(shí)間和增強(qiáng)它的靈敏度[2]。環(huán)引物現(xiàn)已普遍用于LAMP的實(shí)際應(yīng)用中。

2.2 實(shí)時(shí)渾濁度檢測(cè)

只需一臺(tái)帶孵育功能以保證滿足LAMP反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的分光光度計(jì)，不需要添加任何檢測(cè)試劑如熒光試劑。這是因?yàn)長(zhǎng)AMP擴(kuò)增反應(yīng)會(huì)產(chǎn)生一種焦磷酸鎂的衍生物，此衍生物的生成與生成的擴(kuò)增產(chǎn)物成正比，有研究表明通過對(duì)LAMP反應(yīng)的實(shí)時(shí)渾濁度分析，有望對(duì)最初樣品中的DNA模板進(jìn)行定量[3]。

2.3 熒光目視試劑

Tomita等[3]在LAMP反應(yīng)體系中加入鈣黃綠素，可對(duì)反應(yīng)終點(diǎn)進(jìn)行有效判斷。鈣黃綠素與試劑中的錳離子結(jié)合時(shí)處于淬滅狀態(tài)，擴(kuò)增反應(yīng)的副產(chǎn)物焦磷酸離子與錳離子結(jié)合釋放鈣黃綠素，淬滅狀態(tài)解除，發(fā)出熒光。這種簡(jiǎn)單清楚的判斷方法使一些設(shè)備簡(jiǎn)陋的實(shí)驗(yàn)室的使用不受限制。

圖1 靶序列上6個(gè)特異區(qū)域及引物設(shè)計(jì)

3 LAMP方法在檢測(cè)病原體微生物中的應(yīng)用

LAMP技術(shù)初期階段主要用于多種食源性致病菌的快速檢測(cè)，已針對(duì)沙門氏菌(Salmonella spp.)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大腸埃希氏菌（Escherichia coli,）、霍亂弧菌(Vibrio cholera e)等食源性致病菌的LAMP 檢測(cè)方法

3.1 沙門氏菌LAMP檢測(cè)

沙門氏菌是公認(rèn)的食源性疾病最常見的病原菌之一，能引起人類腸胃和其他疾病。雖然基于PCR方法快速檢測(cè)沙門氏菌的方法已經(jīng)建立，但是需要進(jìn)行電泳分析并且用到昂貴的熱循環(huán)系統(tǒng)。2005年Kayoko Ohtsuka 等[5]利用上述LAMP方法對(duì)疑被感染沙門氏菌的110個(gè)水樣雞蛋中進(jìn)行抽樣,經(jīng)過緩沖蛋白胨水中37℃、20h 的前增菌, 檢測(cè)結(jié)果顯示, PCR 漏檢了10%, LAMP及分離培養(yǎng)的檢出率為100% , 但LAMP 比分離培養(yǎng)方法更快速、靈敏和特異。朱勝梅等[7]摸索了LAMP 檢測(cè)沙門氏菌的最佳檢測(cè)反應(yīng)條件, 使沙門氏菌的DNA檢測(cè)靈敏度達(dá)10 fg/反應(yīng), 特異性100%; 對(duì)牛奶樣品中檢出限為102cfu/ mL。

3.2 大腸埃希氏菌(Escherichia.coli) LAMP檢測(cè)

大腸埃希氏菌種的一些特殊的血清型菌株具有致病性，能引起人類腹瀉，通常稱這類大腸桿菌為止瀉性大腸埃希氏菌。由于進(jìn)食致瀉性大腸埃希氏菌污染的食品而引起的食源性疾病的發(fā)病率居高不下, 因此各國(guó)對(duì)此非常重視。致瀉性大腸埃希氏菌類型多、血清型復(fù)雜, 常規(guī)檢測(cè)方法難以有效地實(shí)現(xiàn)快速、靈敏和全面地檢測(cè)。Song 等[13]應(yīng)用LAMP 技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)腸道侵襲性大腸埃希氏菌（EIEC）和志賀氏菌同源基因ipaH 的檢測(cè)。整個(gè)實(shí)驗(yàn)在2 h 內(nèi)完成, 其檢測(cè)限達(dá)到8 cfu/反應(yīng), 與PCR比較, PCR 檢測(cè)限為8×102cfu/反應(yīng)。

3.3 流感病毒（Influenza）LAMP檢測(cè)

流感病毒是引起人類流感的病原體之一，可導(dǎo)致一系列呼吸道疾病，從輕微的上呼吸道癥狀至急性呼吸窘迫綜合癥和多器官功能衰竭，甚至死亡。流感病毒早期的快速檢測(cè)對(duì)流感的防控非常重要。Ito等[4]針對(duì)流感病毒H1和H3亞型的HA基因及乙型流感病毒NP基因，建立了LAMP檢測(cè)方法，比商業(yè)的免疫層析試劑盒靈敏度和專一性更高。Jayawardena等[5]建立了禽流感H5N1特異LAMP技術(shù)，對(duì)近十年間人和禽的H5N1流感病毒均有理想的檢測(cè)效果，其靈敏度高達(dá)0.002 pfu／反應(yīng)。

LAMP 技術(shù)現(xiàn)也成功地用于快速即時(shí)檢測(cè)其他重要的病原體，包括麻疹病毒[3]、登革熱病毒[7]、軍團(tuán)菌[14]、肺孢子蟲性肺炎[1]等。

4 LAMP技術(shù)發(fā)展方向

LAMP技術(shù)初期階段主要用于多種食源性致病菌的快速檢測(cè)，而由于該技術(shù)敏感性高、等溫高效、操作簡(jiǎn)便，有望成為發(fā)展中國(guó)家中很多危險(xiǎn)傳染病的簡(jiǎn)單快速的診斷方法。

4.1 肺結(jié)核（Tuberculosis,TB）LAMP檢測(cè)

TB是發(fā)展中國(guó)家中一種主要的傳染疾病。雖然現(xiàn)在其發(fā)病率在很多發(fā)展中國(guó)家已有所降低，但是影響范圍卻有擴(kuò)大的趨勢(shì)。TB沒有被完全控制其中一個(gè)重要的原因是缺乏簡(jiǎn)便可行且靈敏度比痰涂片檢測(cè)法高的診斷方法。Iwamoto等[19]建立了檢測(cè)肺結(jié)核分支桿菌、鳥分支桿菌和胞內(nèi)分支桿菌的LAMP方法，靈敏度和PCR方法相當(dāng)。Boehme等[16]也建立了LAMP方法用于設(shè)備簡(jiǎn)陋的實(shí)驗(yàn)室，樣品經(jīng)過濾預(yù)處理，后面操作簡(jiǎn)便，靈敏度和商用的核酸擴(kuò)增試驗(yàn)系統(tǒng)相當(dāng)。

4.2 瘧疾（Malaria）LAMP檢測(cè)

瘧疾是嚴(yán)重威脅發(fā)展中國(guó)家兒童和孕婦健康的疾病之一?？焖贉?zhǔn)確檢測(cè)瘧原蟲對(duì)瘧疾的控制和預(yù)防是非常重要的。Han等[18]利用LAMP原理設(shè)計(jì)引物，能區(qū)分4種瘧原蟲，甚至到種的水平，靈敏度和專一性跟巢式PCR相似。Yamamura 等[25]發(fā)明了一種新的快速檢測(cè)惡性瘧原蟲的方法，其聯(lián)合了DNA 濾紙技術(shù)、環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)和熔解曲線的分析技術(shù)，使瘧原蟲的檢出率更加精確，靈敏度、特異性分別為97.8%、85.7%。這些報(bào)告說明LAMP技術(shù)有望成為發(fā)展中國(guó)家瘧疾控制的有力工具。

LAMP技術(shù)除了用于TB和瘧疾的檢測(cè)外，還可用于另外一種發(fā)展中國(guó)家常見的病原菌艾滋病毒的檢測(cè)[2]。此外，LAMP還用于非洲錐蟲?。ɑ杷Y）的檢測(cè)[17]，這是常被忽略的熱帶病。所以快速準(zhǔn)確的診斷是非常重要的。Kuboki等[21]首先將LAMP技術(shù)應(yīng)用于檢測(cè)錐蟲,LAMP法能從1 pg總DNA 中成功擴(kuò)增出布氏錐蟲基因,而傳統(tǒng)PCR 法在總DNA 樣本100 pg以上時(shí)才能檢測(cè)到陽性,前者比后者敏感度高100倍。針對(duì)不同靶基因的不同引物組合也成功地區(qū)分了岡比亞布氏錐蟲、克氏錐蟲、布氏錐蟲、伊氏錐蟲等4 種錐蟲。Njiru等[22]建立了檢測(cè)岡比亞錐蟲的LAMP試驗(yàn)方法，靈敏度達(dá)到10個(gè)寄生蟲/mL血。他們利用重復(fù)插入移動(dòng)因子序列作為靶標(biāo)，成功檢出錐蟲屬亞屬，靈敏度高達(dá)0.001個(gè)寄生蟲/ mL血。

LAMP技術(shù)還可以用于其他傳染病的檢測(cè)如登革熱病毒[7]、埃博拉病毒[6]、乙肝病毒[9]等。至今還沒有足夠簡(jiǎn)便、效率高、花費(fèi)少并適合發(fā)展中國(guó)家基層實(shí)驗(yàn)室通用的核酸擴(kuò)增試驗(yàn)系統(tǒng)。如上所說，LAMP試驗(yàn)不需要精密溫度循環(huán)裝置, 所用設(shè)備簡(jiǎn)單、花費(fèi)少,有望發(fā)展成為最簡(jiǎn)便的核酸擴(kuò)增試驗(yàn)系統(tǒng)，有利于從源頭控制疾病的傳播。

5 展望

最近一些新技術(shù)如芯片實(shí)驗(yàn)室等[24]已發(fā)展和應(yīng)用于分析科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。芯片實(shí)驗(yàn)室（Labon-a-chip）可以理解為把生物和化學(xué)等領(lǐng)域中所涉及的樣品制備、生物與化學(xué)反應(yīng)、分離檢測(cè)等基本操作單位集成或基本集成于一塊幾平方厘米的芯片上，用以完成不同的生物或化學(xué)反應(yīng)過程，并對(duì)其產(chǎn)物進(jìn)行分析的一種技術(shù)。盡管芯片實(shí)驗(yàn)室的這種理念已應(yīng)用于PCR方法[20]，但是LAMP方法的簡(jiǎn)便、靈敏高等優(yōu)點(diǎn)有望使基于芯片實(shí)驗(yàn)室的核酸檢測(cè)系統(tǒng)發(fā)展得更加便利。隨著相應(yīng)診斷試劑盒的開發(fā)，LAMP有望成為一種簡(jiǎn)易的常規(guī)檢測(cè)手段。LAMP是一種便捷、特異而又靈敏的基因檢測(cè)技術(shù)，進(jìn)一步優(yōu)化、完善后將在遺傳病和傳染病的早期診斷方面有很大的應(yīng)用潛力。

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