袁慕云 卓錦雪 許龍巖 陳碧玲 張 旺

（廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局 廣東廣州 510623）

1 前言

金黃色葡萄球菌在食品污染病例中占據(jù)十分重要的位置，同時(shí)也是醫(yī)院臨床感染導(dǎo)致肺炎及傷口感染的主要病原菌。隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，金黃色葡萄球菌對(duì)目前使用的各種抗生素呈現(xiàn)出越來越普遍的耐藥性，并表現(xiàn)為多重耐藥，給臨床治療帶來了很大困難[1-4]。本研究根據(jù)金黃色葡萄球菌的nor A基因序列分別設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物和測(cè)序引物，用PCR-焦磷酸測(cè)序從DNA堿基序列水平上檢測(cè)金黃色葡萄球菌，用Vitek2進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，分析金黃色葡萄球菌耐藥情況。

2 材料和方法

2.1 材料

2.1.1 菌株信息

金黃色葡萄球菌共28株：MRSA(耐甲氧西林金黃色葡萄球菌)臨床分離株9株，菌株編號(hào)為JPA-JPI；不同食品中分離株MSSA(甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌) 19株，菌株編號(hào)為JP1-JP19，菌株信息按文獻(xiàn)5。

陰性對(duì)照菌株8株：分別為單增李斯特菌ATCC19115、阪崎腸桿菌ATCC29544、藤黃微球菌CMCC28001、痢疾志賀氏菌NICPBP51252、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌CMCC52221、肺炎克雷伯氏菌CMCC46102、糞鏈球菌ATCC2921、大腸桿菌ATCC25922。

上述菌株來自中國藥品生物制品鑒定所、華南理工大學(xué)食品學(xué)院和廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心，且均經(jīng)過VITEK 2和API試劑條確證。

2.1.2 主要儀器

焦磷酸測(cè)序PyroMark lD系統(tǒng)：瑞典Biotage公司；PCR擴(kuò)增儀：PE 9700型；核酸提取儀：日本PSS公司。

2.1.3 試劑

PCR用Buffer、d NTP、瓊脂糖、PCR分子量標(biāo)記(50-500 bp)、Taq酶：大連寶生物工程有限公司；焦磷酸測(cè)序用試劑：QIAGEN上海辦事處；7.5 %氯化鈉肉湯：北京陸橋有限公司。

2.2 方法

2.2.1 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)G e n B a n k公布的金黃色葡萄球菌n o r A基因( Gen B an k:D 9 0 11 9.1 )中保守區(qū)域，用Py r o M ar k A ssay D esig n 2.0軟件設(shè)計(jì)引物和測(cè)序引物，上游引物5’-CGAGAGTGATTGGTGGTATGAGTG-3’，下游引物5’-CGCTGACATGTAGCCAAAGTTTT-3’，測(cè)序引物5’-TGGTGTGACAGGTTTAATAG-3’，下游引物5’端標(biāo)記生物素，擴(kuò)增片段大小113bp，委托寶生物工程(大連)有限公司合成。

2.2.2 模板制備、PCR擴(kuò)增體系、電泳參數(shù)、單鏈模板制備及焦磷酸測(cè)序

模板制備、PCR擴(kuò)增體系、電泳參數(shù) 、單鏈模板制備及焦磷酸測(cè)序，按文獻(xiàn)6進(jìn)行。

2.2.3 焦磷酸測(cè)序結(jié)果判斷

從NCBI網(wǎng)站的BLAST功能反復(fù)比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，利用nor A基因測(cè)序引物后的30個(gè)連續(xù)DNA堿基序列5’-CTGACATTTC ACCAAGCCAT CAAAAAGCA-3’，可達(dá)到鑒定金黃色葡萄球菌的目的，因此本研究判斷結(jié)果的依據(jù)為：測(cè)序的30個(gè)DNA堿基序列與上述序列100%匹配，則判斷為金黃色葡萄球菌。

2.2.4 藥敏試驗(yàn)

參照文獻(xiàn)5和文獻(xiàn)7，用AST-GP67藥敏卡，在Vitek 2上對(duì)28株金黃色葡萄球菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。質(zhì)控菌株為為MRSA ATCC29213、MRSS ATCC25923。

3 結(jié)果與分析

3.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

28株金黃色葡萄球菌均擴(kuò)增出113bp大小的nor A基因DNA片段（圖1，本研究只列出20株金黃色葡萄球菌電泳圖），而單增李斯特氏菌等對(duì)照菌株未見擴(kuò)增條帶（圖略）。

圖1 金黃色葡萄球菌nor A基因PCR擴(kuò)增電泳圖

3.2 焦磷酸測(cè)序結(jié)果

根據(jù)模板濃度等條件的不同，28株金黃色葡萄球菌分別測(cè)出37bp-42bp長短不等的DNA堿基序列（表1），圖2、圖3為JPA、JP5焦磷酸測(cè)序結(jié)果圖，而單增李斯特菌等8株對(duì)照株未測(cè)出DNA堿基序列。測(cè)序結(jié)果分別與測(cè)序引物后的DNA序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)100%匹配的DNA堿基數(shù)為34bp-40bp，所有有效測(cè)序結(jié)果均超過30個(gè)堿基（表1），表明測(cè)序引物的特異性較好，擴(kuò)增體系優(yōu)化較佳，并且可用CTGACATTTC ACCAAGCCAT CAAAAAGCA 堿基序列特異性地檢測(cè)金黃色葡萄球菌。

表1 金黃色葡萄球菌焦磷酸測(cè)序檢測(cè)結(jié)果

圖2 JPA焦磷酸測(cè)序結(jié)果圖

圖3 JP5焦磷酸測(cè)序結(jié)果圖

表1顯示，JPA、JP3、JP5、JP6、JP7、JP1 7等6株菌株第5個(gè)堿基均為T，在N CB I網(wǎng)站查找金黃色葡萄球菌n o r A基因序列(GenBank:D90119.1)， 發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)的堿基為C，表明試驗(yàn)菌株在該位點(diǎn)發(fā)生了C-T突變。查找nor A基因編碼的蛋白氨基酸序列，共389個(gè)氨基酸，突變位點(diǎn)是nor A基因第354個(gè)堿基、118個(gè)氨基酸-天冬氨酸位點(diǎn)，該位點(diǎn)發(fā)生C-T的突變后，密碼子GAC變成GAU，而兩個(gè)密碼子都是天冬氨酸的密碼子，表明該基因表達(dá)的nor A蛋白氨基酸序列無變化；JP3、JP5、JP17等3株菌的第28個(gè)堿基均為T，同樣在NCBI網(wǎng)站查找nor A基因序列， 該位點(diǎn)的堿基為C，表明試驗(yàn)菌株在該位點(diǎn)發(fā)生了C-T突變，突變位點(diǎn)是nor A基因的第377個(gè)堿基、126個(gè)氨基酸-丙氨酸位點(diǎn)，該位點(diǎn)發(fā)生C-T的突變后，密碼子GCA變成 GUA，查密碼子表，GCA是丙氨酸氨的密碼子，GUA是纈氨酸密碼子，表明nor A基因編碼的蛋白氨基酸序列發(fā)生了改變。

3.3 耐藥試驗(yàn)結(jié)果

28株金黃色葡萄球菌有14種耐藥譜，其中NA 1：4株；NA 2：6株；NA 11、NA 13：各3株；NA9 、NA14：各2株；NA3、NA4、NA5、NA 6、NA7、NA8、NA 10、NA 12：各1株。具體見表2。

28株菌株對(duì)亞胺培南、萬古霉素、替考拉寧、利福平等8種抗生素均敏感；對(duì)青霉素的耐藥率最高，共有20株，占71.4%；其次為紅霉素、苯唑西林和四環(huán)素，分別占35.7%、32.1%和28.6%。對(duì)青霉素耐藥的20株菌株中，MRSA 9株，MSSA 11株；對(duì)苯唑西林耐藥的9株菌株均為MRSA。具體見表2、表3。

表2 8株金黃色葡萄球菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

表3 28株金黃色葡萄球菌耐藥率

4 討論

目前金黃色葡萄球菌的耐藥性日益惡化，特別是其對(duì)氟喹諾酮類和β-內(nèi)酰胺類藥物呈現(xiàn)超強(qiáng)耐藥。隨著細(xì)菌耐藥性研究的深入，外輸泵nor A基因介導(dǎo)的氟喹諾酮耐藥性逐漸引起人們的重視，不同菌株中該主動(dòng)外排介導(dǎo)的耐藥性表現(xiàn)程度成為人們考查的重點(diǎn)[8-11]。大量研究表明，nor A基因介導(dǎo)的金黃色葡萄球菌對(duì)FQNS耐藥相當(dāng)普遍[12-13]，因?yàn)閚or A基因是金黃色葡萄球菌的結(jié)構(gòu)基因，其編碼的nor A蛋白能將親水性氟喹諾酮類藥物自菌體內(nèi)主動(dòng)泵出，使藥物在菌體內(nèi)蓄積減少。

本研究根據(jù)nor A基因序列分別設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物和測(cè)序引物，用PCR-焦磷酸測(cè)序從DNA堿基序列水平上檢測(cè)金黃色葡萄球菌，用Vitek2進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，分析金黃色葡萄球菌耐藥情況。28株金黃色葡萄球菌均擴(kuò)增出大小113bp大小的DNA片段，焦磷酸測(cè)序結(jié)果與nor A基因測(cè)序引物后的堿基序列比對(duì)，100%匹配的堿基數(shù)均超過30個(gè)DNA堿基序列，而其他如單增李斯特氏菌等對(duì)照菌株P(guān)CR擴(kuò)增結(jié)果和焦磷酸測(cè)序結(jié)果均陰性，表明用nor A為目的基因，可特異性檢測(cè)金黃色葡萄球菌。

耐藥試驗(yàn)結(jié)果顯示，28株金黃色葡萄球菌有14種耐藥譜，其中9株MRSA有4種耐藥譜，19株MSSA有10種耐藥譜。MRSA耐藥譜中，NA11耐藥譜的3株菌株對(duì)兩種抗生素耐藥，其他3種耐藥譜的6株菌株均是多重耐藥菌。MSSA耐藥譜中，NA5 耐藥譜的JP11對(duì)5種抗生素耐藥，JP11是鰻魚中分離的菌株，表明在鰻魚養(yǎng)殖過程中使用了較多的抗生素，出現(xiàn)多重耐藥菌。分析nor A基因突變對(duì)喹諾同類抗生素的耐藥情況，發(fā)現(xiàn)對(duì)喹諾酮類抗生素環(huán)丙沙星耐藥的菌株為NA 5耐藥譜中的JP11和NA12耐藥譜中的JPB，而發(fā)生突變的6株菌株JPA、JP3、JP5、JP6、JP7、JP17分布在NA1、NA2和NA11 等3種不同的耐藥譜中，均對(duì)喹諾酮類抗生素敏感。表明，nor A基因第354和377堿基位點(diǎn)的突變與喹諾酮類抗生素耐藥性無關(guān)。

5 結(jié)論

n or A基因可作為金黃色葡萄球菌分子鑒別的的參考基因，并且可用CTGA CATTTC ACCAAGCCAT CAAAAAGCA 堿基序列特異性地檢測(cè)金黃色葡萄球菌；nor A基因第354和377堿基位點(diǎn)的突變與喹諾酮類抗生素耐藥性無關(guān)。

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