張林田 林 文 陸奕娜 林 超

(汕頭出入境檢驗檢疫局 廣東汕頭 515041)

1 前言

β-受體激動劑在臨床上用于要用于擴(kuò)張支氣管和增加肺通氣量的治療，但當(dāng)大劑量用藥時，在動物身上就表現(xiàn)出脂肪分解增強，蛋白質(zhì)合成增加，可顯著提高瘦肉率和飼料轉(zhuǎn)化率，在畜牧業(yè)上又稱之為瘦肉精。人吃了含有瘦肉精的食品后表現(xiàn)出呼吸加劇、體溫升高、頭痛、心悸、代謝紊亂、出現(xiàn)震顫等癥狀，可誘發(fā)和加重心腦血管病人的病情，因此世界各國都先后將其列為動物性食品中禁用藥物。自2002年起我國將克倫特羅列為食品動物禁用獸藥后，不法分子不斷制造出新的瘦肉精品種，如近期湖南查獲了在飼料中添加以前未出現(xiàn)過的瘦肉精新品種苯乙醇胺A的案件，這再次為食品安全敲響警鐘。

目前，動物源性食品中瘦肉精的檢測標(biāo)準(zhǔn)及文獻(xiàn)資料較多[1-7]，但適用范圍大都僅限于豬肉、豬尿、飼料，而未涉及羊肉、蛇肉、雞肉及動物性制品如火腿腸、臘肉等；同時動物性食品中的苯乙醇胺A的檢測資料則非常少。本文通過對畜禽肉、蛇肉、動物性制品中克倫特羅、萊克多巴胺、苯乙醇胺A及馬步特羅的檢測技術(shù)進(jìn)行研究，建立了快速、準(zhǔn)確、靈敏、高效的UPLC-MS/MS測定方法。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 主要儀器

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀：Thermo TSQ QUANTUM ULTRA/戴安3000；均質(zhì)器：IKA公司；旋渦混勻器：IKA公司；高速冷凍離心機(jī)：日立 CR21GⅢ；電熱恒溫振蕩水槽：上海一恒； 氮吹濃縮儀：EYELA MG-2200；SPE固相萃取裝置：Supelco。

2.1.2 主要試劑

甲醇、乙腈、甲酸：均為TEDIA HPLC級；乙酸銨：Dikmapure；0.2mol/L 乙酸銨溶液（p H 5.2）；5 mmol/L乙酸銨溶液（加0.1%甲酸）；氨水；5%氨水甲醇溶液(v/v)；β-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶溶液 (30U/ mL)：MERCK公司。

苯乙醇胺A、萊克多巴胺、克侖特羅、馬步特羅標(biāo)準(zhǔn)品：純度均大于等于99%?？藗愄亓_-D9（濃度為100 mg/L）：德國DR公司。準(zhǔn)確稱取上述適量標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇配制成濃度為100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。標(biāo)準(zhǔn)溶液系列用5mmol/L乙酸銨溶液配制。

PCX固相萃取柱：60mg，3mL或相當(dāng)者，艾杰爾公司。

2.2 方法

2.2.1 液相色譜參考條件

柱溫：35℃；進(jìn)樣量：30μL；色譜柱：Waters Atlantis d C18 (100mm×2.1mm)；流速0.3m L/min；流動相：A為乙腈，B為 5mmol/L乙酸銨水溶液（加0.1%甲酸），梯度洗脫程序如下：0-6min，B由2%升到20%，6-10min，B由20%升到70%，保持4min，0.5min內(nèi)，10-14min，B由70%降到2%，保持2.5min。

2.2.2 質(zhì)譜參考條件

串聯(lián)四極桿電噴霧ESI離子源，正離子電離模式；噴霧電壓：3000V；霧化室溫度：450℃；鞘氣流量：35 mL/min；輔助氣流量：6 mL/min；毛細(xì)管溫度：320℃。檢測條件如表。

表1 β-受體激動劑的檢測條件

2.2.3 樣品前處理

2.2.3.1 酶解

準(zhǔn)確稱取2.0g試樣于50 m L離心管中，加入5mL p H 5.2的0.2mol/L乙酸銨緩沖液，1000r/min勻漿1min，再加入β-葡糖醛酸苷肽酶/芳基硫酸酯酶溶液40μL,200μL 10μg/L的同位素內(nèi)標(biāo)工作溶液，渦旋混勻3min,于37℃電熱恒溫振蕩水槽中水解過夜。將水解液渦旋混勻3min，10000r/min離心10min，上清液經(jīng)濾紙過濾于10 mL比色管中，殘渣再用提取液溶解，混勻、離心、過濾于比色管中，定容搖勻。

2.2.3.2 凈化

將經(jīng)甲醇活化、去離子水洗滌的PCX固相萃取柱連接到固相萃取裝置上，取上述提取液5 mL以小于1mL/min的速度過柱，依次用3mL水、3mL甲醇洗滌柱子并徹底抽干，最后用2mL 5%氨水甲醇洗脫。洗脫液在40℃用氮氣吹至近干，加0.5 mL流動相溶解，渦旋混勻，14000r/min離心6min，過0.2μm濾膜，待測。

3 結(jié)果與討論

3.1 提取液種類的選擇

苯酚型瘦肉精在生物機(jī)體內(nèi)的代謝以軛合態(tài)存在，其殘留檢測必須經(jīng)過水解過程，常用的水解方法主要有酸解、堿解和酶解等[1-7]。酶水解法常采用β-葡糖醛酸苷肽酶/芳基硫酸酯復(fù)合酶進(jìn)行水解，該復(fù)合酶在p H 5.2及37℃時活性最好，前處理時應(yīng)嚴(yán)格控制。通常在樣品中加入緩沖溶液以控制pH值,如國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T21313-2007[2]采用pH值5.2的乙酸銨緩沖液作為提取液。選擇37℃水浴恒溫水解，水解的時間可根據(jù)試驗需要適當(dāng)調(diào)整。

3.2 提取方法

多數(shù)瘦肉精為中等極性的疏水性物質(zhì)，呈弱堿性（苯胺型）或酸堿兩性（苯酚型），有機(jī)溶劑和pH值是影響提取效率的兩大因素。一般操作步驟是先將水解液p H至1，離心后的上清液再用10mol/L氫氧化鈉調(diào)p H至11，再用有機(jī)溶劑萃取[1-7]。液-液萃取凈化方法是經(jīng)典方法，但操作煩瑣，耗時費力，效率低下，本研究采用水解后直接進(jìn)行固相萃取柱凈化濃縮，簡化前處理步驟，提高工作效率，節(jié)約試劑能源，經(jīng)驗證，準(zhǔn)確度及精密度均符合要求。

圖1 4種目標(biāo)物二級質(zhì)譜圖

3.3 提取次數(shù)的影響

在提取過程中，提取次數(shù)對回收率有著重要影響，提取次數(shù)如不夠，提取不完全，目標(biāo)物損失較多，而提取次數(shù)過多，既造成試劑浪費又造成檢測時間太長，工作效率低。采用2μg/kg豬肉添加樣品，比較提取次數(shù)對測定結(jié)果的影響，結(jié)果見表2。可得出，如只提取一次，則還有部分被測物提取不完全殘留在殘渣里，第3次提取液則均為未檢出。

表2 提取次數(shù)對測定結(jié)果的影響

3.4 洗脫液體積的選擇

洗脫液體積不僅可以保證較高的回收率，還可避免浪費溶劑，縮短試驗時間，提高工作效率。取4μg/L的標(biāo)準(zhǔn)混合液過固相萃取柱，考察不同洗脫體積對測定結(jié)果的影響，試驗結(jié)果見表3。試驗結(jié)果可知，用2mL5%氨化甲醇洗脫時，4種目標(biāo)物的回收率最大。

表3 固相萃取洗脫體積對測定結(jié)果的影響

3.5 流動相的選擇

現(xiàn)行有效的瘦肉精檢測的標(biāo)準(zhǔn)方法中，大都采用0.1%甲酸和甲醇或乙腈搭配作為流動相，研究比較0.1%甲酸-甲醇與0.1%甲酸-乙腈作為流動相，對比發(fā)現(xiàn)，甲醇這組流動相出峰時間相對較緩慢，響應(yīng)強度比乙腈稍高，但苯乙醇胺A不出峰，相比之下，在同樣流速條件下，乙腈這組流動相中4種成分均出峰，出峰時間相比較甲醇這組也稍快些，4種成分均達(dá)到最大分離，選擇乙腈作為有機(jī)相。在流動相水相中加入少許乙酸銨，可明顯提高靈敏度，提高信噪比。

3.6 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

在保持流動相以初始比例運行時，將1mg/L的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液用蠕動泵以5μL/min流動注射方式進(jìn)樣，優(yōu)化質(zhì)譜條件，選擇最優(yōu)的離子源參數(shù)及碰撞能、錐孔電壓等參數(shù)，結(jié)果見表1。4種化合物的二級譜圖見圖1。

圖2 0.5μg/L標(biāo)液 4種目標(biāo)物的多反應(yīng)監(jiān)測譜圖

3.7 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線、線性及檢出限

用流動相配制濃度分別為0、0.5、1.0、2.5、5.0、7.5、10.0μg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作系列，內(nèi)標(biāo)濃度為2.0μg/L，按本法分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。結(jié)果表明，4種化合物在0-10.0μg/L濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r2均＞0.999，回歸方程和相關(guān)系數(shù)列于表4，提取離子多反應(yīng)監(jiān)測圖見圖2。

表4 4種瘦肉精線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)

3.8 方法定量檢測限

采用0.5μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖，以峰峰比計算信噪比，結(jié)果見表4。以10倍信噪比計算定量檢測限，再根據(jù)本方法的操作步驟結(jié)合文獻(xiàn)資料，確定方法定量檢測限均為0.5μg/kg。蛇肉、豬腎陰性樣品在0.5μg/kg添加水平的提取離子流圖見圖3-4。

3.9 回收率試驗和重復(fù)性試驗

取豬肉空白樣品，按0.5μg/kg、1.0μg/kg、5.0μg/kg濃度水平添加，做6次平行試驗，結(jié)果見表5。豬、牛、雞、鴨、羊、蛇肉、奶粉等基質(zhì)樣品在0.5、1.0、5.0μg/kg 3個濃度水平加標(biāo)回收率為70.2%-119.8%，6次測定的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差3.8%-19.1%。另取豬心、豬腎、豬肝、臘肉、火腿腸等樣品，按本法進(jìn)行檢測，也取得較好的結(jié)果。

圖3 0.5μg/kg添加水平蛇肉的提取離子流圖

圖4 0.5μg/kg添加水平豬腎的提取離子流圖

表5 不同基質(zhì)樣品回收率與精密度實驗結(jié)果（n=6）

4 方法協(xié)同實驗

以豬肉為供試品，按0.5μg/kg、1.0μg/kg、5.0μg/kg濃度水平添加，除本室外，委托另3家通過認(rèn)可的實驗室按本法檢測4種瘦肉精殘留，協(xié)同實驗結(jié)果：回收率范圍為84.0% -120.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為6.1%-12.8%。

5 結(jié)論

通過研究建立了動物性食品中4種瘦肉精的檢測方法，該方法可檢測瘦肉精新品種苯乙醇胺A；適用范圍廣，可檢測畜禽產(chǎn)品、乳制品、蛇等產(chǎn)品；處理簡單，可大幅提高工作效率。方法精密度和準(zhǔn)確度高、適用性強，適用于各種動物性制品中這4種瘦肉清的檢測。

［1］ GB/T 22286-2008 動物源性食品中多種β2受體激動劑殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[S].

［2］ GB/T21313-2007 動物源性食品中β受體激動劑殘留量檢測方法 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法[S].

［3］ SN/T1924-2011 進(jìn)出口動物源食品中克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇和特布它林殘留量的測定 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法[S].

［4］ 農(nóng)業(yè)部958號公告-3-2007 動物源性食品中萊克多巴胺殘留量的測定 高效液相色譜-質(zhì)譜法[S].

［5］ 農(nóng)業(yè)部1025號公告-18-2008 動物源性食品中β受體激動劑殘留量檢測 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[S].

［6］ 朱堅, 李波, 方曉明, 等.氣相色譜-質(zhì)譜法測定肝、腎和肉中11種β-受體激動劑殘留量[J].質(zhì)譜學(xué)報，2005,26(3):129-137.

［7］ 金玉娥，郭德華，鄭燁，等.液質(zhì)聯(lián)用儀測定動物源性食品中11種β2-受體激動劑的研究[J].質(zhì)譜學(xué)報，2007，28(4):193-201.