丁 琦，林偉新,蔡教英，林國生，王小玉，游淑珠，陳俊言，許喜林

(1.華南理工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣州 510640;2.珠海出入境檢驗(yàn)檢疫局,珠海 519000)

大腸埃希氏菌(DiarrheagenicEscherichiacoli)是一類能引起人體以腹瀉癥狀為主的細(xì)菌，可經(jīng)過污染食物引起人類發(fā)病。常見的致瀉大腸埃希氏菌主要包括腸道致病性大腸埃希氏菌(EPEC)、腸道侵襲性大腸埃希氏菌(EIEC)、產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌(ETEC)、產(chǎn)志賀毒素大腸埃希氏菌(包括腸道出血性大腸埃希氏菌，STEC/EHEC)和腸道集聚性大腸埃希氏菌(EAEC)，雖然類別多樣，但都是能夠通過傳播導(dǎo)致人畜共患病的病原菌[1-2]。據(jù)統(tǒng)計，美國近年來除腸道出血性大腸埃希氏菌O157外引起的食源性疾病致病病例中，有71%是由O26、O45、O103、O111、O121和O145血清型所致[3]，其中O26的報道較多。腸道出血性大腸埃希氏菌 O26現(xiàn)已經(jīng)逐漸成為美國、加拿大、澳大利亞及部分歐盟發(fā)達(dá)國家引起人類食源性疾病的主要病原菌[4-8]。因此，快速檢測和鑒別食品中腸道出血性大腸埃希氏菌O26是保障食品質(zhì)量安全和防止食源性疾病暴發(fā)的有效手段。本文主要應(yīng)用PCR方法，通過設(shè)計引物，優(yōu)化反應(yīng)條件，建立食品中大腸埃希氏菌O26血清型的PCR檢測方法，以便對其進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的檢測，并有利于克服傳統(tǒng)分離鑒定方法耗時費(fèi)力、步驟繁瑣等不足之處。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌株

目標(biāo)菌株：大腸埃希氏菌ATCC 12795。非目標(biāo)菌株：大腸埃希氏菌ATCC BAA-2469、大腸埃希氏菌ATCC 23982、大腸埃希氏菌ATCC 35150、大腸埃希氏菌CCTCC AB 200051、大腸埃希氏菌EHEC Stx1、大腸埃希氏菌EHEC Stx2、大腸埃希氏菌NCTC 12900、大腸埃希氏菌EC O104、大腸埃希氏菌ATCC 43887、大腸埃希氏菌ATCC 29552、大腸埃希氏菌ATCC 33780、大腸埃希氏菌ATCC BAA-2190。

1.1.2 主要試劑

營養(yǎng)肉湯(廣州環(huán)凱)；腸道菌增菌肉湯(北京路橋)；DNA 提取試劑盒(Tiangen公司)；PCR反應(yīng)預(yù)混液、DNA Marker DL2000(TAKARA公司)；引物(Invitrogen 公司)；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒DP302-02 (天根生化科技有限公司)；瓊脂糖H(生工生物工程(上海)股份有限公司)；Premix ExTaq2× (大連寶生物公司)。

1.1.3 主要儀器設(shè)備

培養(yǎng)箱(BINDER)；高壓滅菌鍋(HIRAYAMA)；超低溫冰箱(Thermo)；超微量分光光度計(Thermo)；高速離心機(jī)(艾本德)；梯度PCR儀(艾本德)；電泳儀(Bio-Rad)；凝膠成像系統(tǒng)(Alpha Innotech)。

1.1.4 PCR引物序列

表1 引物序列與相關(guān)參數(shù)Table 1 Sequences and parameters of the primers

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取、濃度及純度的測定

采用DNA提取試劑盒(離心柱型)提取DNA，按照試劑盒提供的說明書進(jìn)行操作。使用超微量分光光度計測DNA的濃度。

1.2.2 PCR反應(yīng)的建立

反應(yīng)體系：Premix ExTaq(2×) 12.5 μL，引物對工作液1 μL，加DNA模板2 μL，加ddH2O 9.5 μL至25 μL。反應(yīng)條件如下：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性20 s，72℃延伸1 min。我們分別對影響PCR擴(kuò)增的循環(huán)數(shù)、引物濃度、退火溫度等因素進(jìn)行探究和優(yōu)化，以先確定退火時間、退火溫度，最后確定循環(huán)數(shù)的順序探究。退火時間梯度為30、60、90 s；退火溫度梯度為55.2℃、55.8℃、56.7℃、57.8℃、59.1℃、60.4℃、61.7℃、62.9℃、63.9℃及64.6℃；循環(huán)數(shù)為30、35和40個，分別在不同的退火溫度下同時擴(kuò)增各目標(biāo)片段。5 V/cm恒壓電泳30 min，用凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析。

1.2.3 特異性試驗(yàn)

將目標(biāo)菌株和非目標(biāo)菌株的DNA作為模板，采用優(yōu)化好的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行PCR檢測，以評價引物的特異性。

1.2.4 靈敏度試驗(yàn)

將經(jīng)提取的模板DNA，用核酸蛋白分析儀測定其核酸濃度，按照10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7和10-8稀釋成濃度梯度，每個稀釋度分別吸取2 μL用于PCR實(shí)驗(yàn)，以ddH2O代替DNA模板作為陰性對照，采用優(yōu)化好的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行PCR檢測，以確定其靈敏度。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR反應(yīng)體系的建立

2.1.1 退火時間的優(yōu)化

從圖1可以看出，在30、60和90 s 3個退火時間都有較清晰條帶并且特異性較好，沒有雜帶；退火時間為90 s的擴(kuò)增條帶有點(diǎn)拖尾，30 s條帶稍亮于60 s條帶。在沒有明顯差異時，考慮到退火時間短可以降低非特異性擴(kuò)增概率，同時考慮檢測的快捷原則，所以選擇30 s作為PCR反應(yīng)的退火時間。

M：DL2000 Marker ；1～2：退火時間30 s；3～4：退火時間60 s；5～6：退火時間90 s

圖1退火溫度對單重PCR的影響
Figure 1 The effect of annealing temperature on PCR

2.1.2 退火溫度的優(yōu)化

從圖2可以得知，在10個退火溫度梯度都有較清晰條帶并且特異性較好，沒有雜帶。考慮到退火溫度在亮度無明顯差異時選擇較高溫度可以避免非特異性結(jié)合，選擇60.4℃作為PCR反應(yīng)條件的退火溫度。

M：2000 bp Marker；O26退火溫度，1～10分別為55.2℃、55.8℃、56.7℃、57.8℃、59.1℃、60.4℃、61.7℃、62.9℃、63.9℃和64.6℃

圖2退火溫度對單重PCR的影響
Figure 2 The effect of annealing temperature on PCR

2.1.3 循環(huán)數(shù)的摸索

從圖3可以得知，O26菌株在30、35、40這3種循環(huán)數(shù)下擴(kuò)增都有較清晰條帶并且特異性較好，沒有雜帶；所以我們選擇35個循環(huán)作為單重PCR的反應(yīng)條件。

M：2000 bp Marker；O26循環(huán)數(shù)，1～2為30個循環(huán)；3～4為35個循環(huán)；5～6為40個循環(huán)

圖3循環(huán)數(shù)對PCR的影響
Figure 3 The effect of recurring number on PCR

綜上所述，確定PCR體系：Premix ExTaq2×12.5 μL ，引物對工作液1 μL，加DNA模板2 μL，加ddH2O補(bǔ)至25 μL。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性20 s ，60.4℃退火30 s，35個循環(huán)；72℃延伸1 min。

2.2 特異性試驗(yàn)

將所有菌株的DNA分別吸取2 μL用于PCR實(shí)驗(yàn)，在同一反應(yīng)體系中加入大腸埃希氏菌ATCC 12795核酸模板1 μL作為陽性對照，采用優(yōu)化好的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行PCR檢測O26血清型特異基因，以確定其特異性，所有菌株擴(kuò)增結(jié)果與預(yù)期結(jié)果完全一致，擴(kuò)增電泳圖如圖4。

M：DNA Marker DL2000；1：大腸埃希氏菌ATCC 12795；2：大腸埃希氏菌ATCC 12795；3：大腸埃希氏菌ATCC BAA-2469；4：大腸埃希氏菌ATCC 23982；5：大腸埃希氏菌ATCC 35150；6：大腸埃希氏菌CCTCC AB 200051；7：大腸埃希氏菌EHEC Stx1；8：大腸埃希氏菌EHEC Stx2；9：大腸埃希氏菌NCTC 12900；10：大腸埃希氏菌EC O104；11：大腸埃希氏菌ATCC 43887；12：大腸埃希氏菌ATCC 29552；13：大腸埃希氏菌ATCC 33780；14：大腸埃希氏菌ATCC BAA-2190

圖4 PCR特異性試驗(yàn)
Figure 4 Specificity test of PCR reaction

2.3 靈敏度試驗(yàn)

將濃度為100 ng/μL的核酸逐步進(jìn)行10倍稀釋后分別進(jìn)行PCR反應(yīng)通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，核酸經(jīng)過10-8倍稀釋后，普通PCR 產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖電泳染色后能觀測到1 pg/μL濃度的條帶，結(jié)果見圖5。這說明該反應(yīng)的靈敏度能達(dá)到1 pg/μL。

M：DNA Marker DL2000；1～9：大腸埃希氏菌ATCC 12795核酸100～10-8稀釋物各2 μL

圖5擴(kuò)增靈敏度試驗(yàn)
Figure 5 sensitivity test of PCR reaction

2.4 樣品加標(biāo)試驗(yàn)

將新鮮培養(yǎng)的目標(biāo)菌制成約0.35 McF濃度的菌懸液，10倍遞增稀釋至10-7稀釋度，此時樣品菌懸液濃度為10 CFU/mL的菌懸液用于樣品加標(biāo)試驗(yàn)。無菌取25 g食品樣品至225 mL EC肉湯，分別添加對應(yīng)目標(biāo)菌株10 CFU/mL的菌懸液1 mL加至食品樣品肉湯制備成10 CFU/25 g的加標(biāo)樣品，拍擊式均質(zhì)器均質(zhì)2 min。將上述EC肉湯置36℃增菌24 h，分別采用普通PCR進(jìn)行檢測。各濃度添加樣品試驗(yàn)結(jié)果與預(yù)期一致，其檢測靈敏度可達(dá)10 CFU/25 g。

3 討論

目前對于食品中大腸埃希氏菌的檢測，基本上采用的是傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)方法，檢驗(yàn)步驟繁雜，周期長[9]。而PCR比傳統(tǒng)微生物檢驗(yàn)更快速，比核酸探針檢測法更廉價。本研究建立的方法比特異性高，靈敏度高，適用于臨床診斷、食品衛(wèi)生監(jiān)控及進(jìn)出口食品安全檢測，具有較強(qiáng)的實(shí)際應(yīng)用價值，可推廣使用。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，使用該引物可以對大腸埃希氏菌O26進(jìn)行特異性擴(kuò)增以達(dá)到檢測目的。大腸桿菌作為較常見的污染致病菌，雖然國內(nèi)外都有使用PCR檢測大腸桿菌的相關(guān)研究，但大多是檢測大腸桿菌O157：H7，并且多與沙門氏菌、金黃色葡萄球菌聯(lián)同檢測[10]。近兩年國外有少量以大腸埃希氏菌O26為對象的研究[11-13]，國內(nèi)針對大腸埃希氏菌O26的研究較少，這也就是本論文研究的必要性。通過本文的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，一方面可以豐富大腸埃希氏菌主干研究內(nèi)容，為其檢測和應(yīng)用提供可能性；另一方面可以為食源性污染提供快速檢測方法，降低生活中食源性疾病暴發(fā)的可能性。