魏冬旭 胡 珅 孫 瑩 胡少新 韓廣源*

(1.黑龍江出入境檢驗檢疫局 黑龍江哈爾濱 150001；2.齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院；3.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉米研究所)

1 前言

乙二胺四乙酸二鈉對食品有護色、防腐、抗氧化和穩(wěn)定的作用，可阻止或延緩食品褪色、氧化、酸敗、渾濁及風(fēng)味改變等，因此GB 2760-2011《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中允許在軟飲料、果醬、復(fù)合調(diào)味料、罐頭、地瓜果脯等食品中使用乙二胺四乙酸二鈉[1]。但是食入過多的乙二胺四乙酸二鈉，會導(dǎo)致人體微量元素的流失，影響身體健康，還可引起嘔吐、腹瀉和急腹痛等癥狀。因此，各國政府對此都非常重視，制定了嚴(yán)格的限量要求，乙二胺四乙酸二鈉在各類食品中殘留限量在25mg/kg-365 mg/kg之間[2]。

目前，國內(nèi)外關(guān)于食品中乙二胺四乙酸二鈉的檢測方法主要有高效液相色譜法[3-7]、薄層色譜法[8]、離子色譜法[9-10]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[11]；國內(nèi)涉及的檢測標(biāo)準(zhǔn)主要有2個[12-13]，但只適用于糖水板栗、蘋果汁罐頭和鐵強化醬油?，F(xiàn)有文獻和檢測標(biāo)準(zhǔn)未能完全覆蓋表1中對食品檢測所要求的品種，而且有些標(biāo)準(zhǔn)、文獻采用CuCl2作為衍生化試劑，和乙二胺四乙酸二鈉絡(luò)合后并不穩(wěn)定，如果樣品中含有Fe3+，所進行的檢測將不準(zhǔn)確[14]；有些基質(zhì)干擾大的樣品檢測低限不能滿足限量25mg/kg要求。因此研究適合大多數(shù)食品品種，滿足食品添加劑限量要求的乙二胺四乙酸二鈉檢測方法非常必要。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 儀器

液相色譜儀：Agilent 1200，配備紫外檢測器（VWD）；電子天平：上海恒平科學(xué)儀器公司，MP5002；組織搗碎機：Morgec MBL 10；離心機：XiangYi L-550；均質(zhì)器：IKA?T25；水相濾膜：0.45μm。

2.1.2 試劑

甲醇、三氯甲烷：色譜純；磷酸二氫鉀、三氯化鐵、磷酸：分析純；乙二胺四乙酸二鈉標(biāo)準(zhǔn)品（CAS：6381-92-6）：購自Sigma-Aldrich公司，純度≥99%；實驗用水均為去離子水。

2.2 方法

2.2.1 樣品前處理

2.2.1.1 樣品提取

啤酒、果酒、果汁飲料、茶飲料：稱取試樣5 g(精確到0.01 g)于50 mL 玻璃具塞離心管中，加入40 mL水，待衍生化。

八寶粥、番茄醬、藍莓果醬、魚罐頭、沙拉醬、金針磨罐頭、板栗罐頭：經(jīng)組織搗碎機均質(zhì)制備后，稱取試樣5 g (精確到0.01 g)于50 mL旋蓋聚丙烯離心管中，加入15 m L水、20 m L三氯甲烷，10000 r/min均質(zhì)2 min，4500 r/min 離心5 min。將上清液轉(zhuǎn)移至50 mL玻璃具塞離心管中，再用15 mL水重復(fù)提取2次，合并提取液于50 mL玻璃具塞離心管中，待衍生化和凈化。

2.2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取適量的乙二胺四乙酸二鈉標(biāo)準(zhǔn)品，用水溶解并定容至100 mL棕色容量瓶中，得濃度為10 mg/ mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，此溶液轉(zhuǎn)移至儲液瓶中4 ℃下儲存一周。使用前根據(jù)需要將標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液配制成適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

2.2.1.3 衍生化

標(biāo)準(zhǔn)溶液的衍生化：準(zhǔn)確吸取適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液于50 mL玻璃具塞離心管中，加入40 mL水和1.0 mL 0.02mol/L三氯化鐵溶液，混合，超聲20mim；冷卻至室溫后，轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中，用水定容至刻度。

樣品溶液的衍生化：向上述樣品提取溶液中加入1.0 mL 0.02mol/L三氯化鐵溶液，混合，超聲20mim；冷卻至室溫后，轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中，用水定容至刻度。

2.2.1.4 凈化

準(zhǔn)確移取5 mL上述衍生化樣品溶液于25 mL玻璃具塞離心管中，加入5 mL三氯甲烷，在旋渦混合器上混合2 min，4000 r/min 離心5 min。取上清液過0.45 μm濾膜供液相色譜儀測定。

2.2.2 液相色譜分析條件

色譜柱：SAX柱，150 mm×4.6 mm（i.d.），粒度5.0 μm；流動相：A（甲醇）:B（0.075 mol/L 磷酸二氫鉀溶液，p H=2.3）=10:90（V/V）；流速：1.0 mL/min；柱溫：25℃；波長：260nm；進樣量：20 μL。

3 結(jié)果與討論

3.1 提取試劑的選擇

由于乙二胺四乙酸二鈉易溶于水，微溶于乙醇，不溶于乙醚，所以本方法選用水作為提取劑。

3.2 衍生化方法的選擇

與ED TA螯合的金屬離子穩(wěn)定性排序為Mo6+>Bi3+> Fe3+> Cu2+> Zn2+> Fe2+> Mn2+> K+>Ca2+> Mg2+，溶液中存在多種金屬離子時，EDTA螯合優(yōu)先與穩(wěn)定常數(shù)大的金屬離子進行反應(yīng)，雖然Mo6+和Bi3+穩(wěn)定常數(shù)大，但在食品中含量極微量，所以本方法中選擇FeCl3作為衍生化試劑。本方法分別對衍生化時間、衍生化溫度、衍生試劑濃度3方面條件進行了優(yōu)化。

3.2.1 衍生化時間

移取500μg/mL乙二胺四乙酸二鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液于50mL不同的離心管中，分別加入0.1mol/L FeCl3溶液和40mL水，混合后在80℃水浴中進行10min、20min、30min、45min、60min、90min反應(yīng)時間試驗和超聲波試驗；反應(yīng)結(jié)束后冷卻并用水定容至50mL進行測定，結(jié)果見圖1。從圖1可以看出，乙二胺四乙酸二鈉衍生化的反應(yīng)時間無明顯差異。

圖1 乙二胺四乙酸二鈉衍生化反應(yīng)時間試驗

3.2.2 超聲波和衍生溫度試驗

按3.2.1的條件，在25℃、45℃、60℃、70℃、80℃下反應(yīng)10min后進行測定，測定結(jié)果見圖2。從圖2可以看出，乙二胺四乙酸二鈉衍生化的反應(yīng)溫度間無明顯差異。

圖2 乙二胺四乙酸二鈉衍生化的反應(yīng)溫度試驗

3.2.3 衍生試劑濃度試驗

按3.2.1的條件，在50mL不同的離心管中加入1mL濃度分別0.1mol/L、0.05mol/L、0.04mol/L、0.03mol/L、0.02mol/L 的FeCl3溶液，在超聲波中反應(yīng)10min后進行測定，測定結(jié)果見圖3。從圖3可以看出，乙二胺四乙酸二鈉衍生化試劑的溶液濃度間無明顯差異。

圖3 乙二胺四乙酸二鈉衍生化試劑的溶液濃度試驗

綜上所述，乙二胺四乙酸二鈉衍生化條件：在25℃下，選擇0.02mol/L FeCl3的溶液1mL，超聲反應(yīng)10min。

3.3 樣品凈化

對于基質(zhì)比較復(fù)雜的樣品，在樣品提取過程中加入一定量的三氯甲烷，可以去除樣品中色素、脂肪等干擾物質(zhì)。由于乙二胺四乙酸二鈉只溶于水，不溶于有機溶劑，用三氯甲烷可以起到初步的凈化效果。在樣品溶液衍生化后，再次加入三氯甲烷，在旋渦混合器上混合2 min，4 000 r/min 離心5 min。取上清液過0.45 μm濾膜供液相色譜儀測定，在液相色譜上已完全沒有干擾物質(zhì)存在，液相色譜所用的陰離子交換色譜柱在這里也起到了一定的分離作用。

3.4 色譜柱和流動相的選擇

經(jīng)文獻查閱，分析乙二胺四乙酸二鈉衍生物常用的色譜柱為C18液相色譜柱。本試驗首先選擇XDB-C18、XDB-C8、SB-C18、Extend-C18(150mm×4.6 mm i.d.，5 μm)作為液相色譜柱和甲醇-0.02mol/L四丁基氫氧化銨水溶液（p H 3.5）作為流動相進行了實驗。結(jié)果表明：這4款色譜柱對乙二胺四乙酸二鈉衍生物都能達到分離目的，但對干擾物質(zhì)的分離效果不好，影響乙二胺四乙酸二鈉衍生物的測定。通過對乙二胺四乙酸二鈉衍生物結(jié)構(gòu)分析研究，認(rèn)為該化合物仍然以陰離子形式存在，所以選擇一款A(yù)gilent SAX陰離子交換色譜柱(150mm×4.6 mm i.d.，5 μm)進行試驗，同時選擇甲醇-磷酸二氫鉀溶液（10+90）作為流動相，其磷酸二氫鉀溶液濃度分別為0.025mol/L、0.05mol/L、0.075mol/L、0.1mol/L，每一濃度用磷酸調(diào)節(jié)溶液的p H分別為2.3、2.5、3.0進行試驗。

試驗表明：0.0 75 mo l/L磷酸二氫鉀溶液（pH=2.3）時，其乙二胺四乙酸二鈉衍生物的保留時間比較適中，在7.7min左右出峰，且與干擾物能進行有效地分離，具體分析見圖4。所以本實驗方法選擇甲醇-0.075mol/L磷酸二氫鉀溶液（p H=2.3）（10+90，V/V）作為流動相。

圖4 啤酒中乙譜胺四乙酸二鈉色

3.5 線性范圍、檢出限與定量限

配制一系列不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液，在方法確定的實驗條件下進行分析，測定其峰面積，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，乙二胺四乙酸二鈉衍生物的濃度在1.0μg/m L-100.0μg/m L范圍內(nèi)時，線性關(guān)系良好，其回歸方程和相關(guān)系數(shù)分別為Y=28.5027487X - 3.683和0.9997。在空白基質(zhì)中添加標(biāo)準(zhǔn)品，以信噪比(S/N)≥3 計算方法的檢出限(LOD)；以信噪比(S/N)≥10 計算方法的定量限(LOQ)，該方法的LOD和LOQ分別為10 mg/kg和25 mg/kg。

3.6 回收率與精密度

以啤酒、果酒、果汁飲料、茶飲料、八寶粥、番茄醬、藍莓果醬、魚罐頭、沙拉醬、金針磨罐頭、板栗罐頭為樣品，采用標(biāo)準(zhǔn)添加法對添加樣品分別進行回收率和精密度實驗，每個樣品做3個添加水平，每個添加水平做6次平行，以啤酒、八寶粥和板栗罐頭數(shù)據(jù)為例，結(jié)果見表1。其平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為88.64% -96.25%和4.86%-12.59%，結(jié)果符合SN/T 0001-1995《出口商品中農(nóng)藥、獸藥殘留量及生物毒素檢驗方法標(biāo)準(zhǔn)編寫的基本規(guī)定》對回收率和精密度的要求[14]。

表1 啤酒、八寶粥和板栗罐頭中乙二胺四乙酸二鈉的平均回收率和精密度（n=6）

4 結(jié)論

本文建立了適用于不同食品基質(zhì)中乙二胺四乙酸二鈉的前處理方法和高效液相色譜檢測方法，完全能夠滿足我國對外貿(mào)易和進出口商品檢驗把關(guān)的限量要求，解決了不同食品基質(zhì)中乙二胺四乙酸二鈉的檢測問題，為食品安全檢測提供實際方法和技術(shù)支撐。

［1］ GB 2760-2011 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)[S].

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