毛曉露 曹淑彥 廖華 王宇學(xué)＊

新發(fā)現(xiàn)的Salusins基因是一種心血管活性肽，包含相關(guān)肽分子Salusin-α和Salusin-β，分別由28個氨基酸和20個氨基酸組成，是編碼扭轉(zhuǎn)蛋白2A （Torsin Family 2，Member A，TOR2A）基因的選擇性剪接產(chǎn)物［1］。Salusin-α和Salusin-β均具有促進血管平滑肌細胞（VSMCs）和成纖維細胞有絲分裂的作用。Salusin-α可抑制人巨噬泡沫細胞形成，Salusin-β則對其具有明顯促進作用［2～4］。Iso等［5］、Watanabe等［6］報道冠狀動脈狹窄患者血清Salusin-α水平顯著低于輕度高血壓患者和健康志愿者，且急性冠狀動脈綜合征（ACS）患者血清Salusin-α水平下降與動脈粥樣硬化（AS）程度一致，表明Salusin-α可能具有抑制AS 的作用。為了進一步闡明Salusin-α抗AS機制，通過促進和抑制Salusin-α表達，探討Salusin-α對乙酰輔酶A 乙酰轉(zhuǎn)移酶1（ACAT1）及清道夫受體（SAR）表達的影響，為其抑制VSMCs泡沫化和AS提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑

ACAT1和SA-R 抗體（Cayman 公司，美國）；Salusin-α抗體（Phoenix Pharmaceuticals公司，美國）；氧化低密度脂蛋白（oxLDL）（協(xié)生生物科技有限責任公司，中國）；pcDNA3.1-EGFP 質(zhì)粒（Gene-Copoeia公司，美國）；psiHIV-U6質(zhì)粒（GeneCopoeia公司，美國）；人源VSMCs細胞（Cascade biologics公司，美國）；Western Blot試劑盒（KPL公司，美國），DMEM（Gibco公司，美國）；DAB 顯色試劑盒（KPL公司，美國）；Lenti-PacTM慢病毒包裝試劑盒（GeneCopoeia 公司，美國）；脂質(zhì)體（InvivoGen 公司，美國），其它試劑由北京中生北控生物科技股份有限公司提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 構(gòu)建pcDNA3.1-Salusin-α-EGFP 和psi-HIV-U6-Salusin-α質(zhì)粒：按分子生物學(xué)標準操作流程［7］將Salusin-α基因克隆入含有EGFP（綠色熒光蛋白）報告基因的哺乳動物表達載體pcDNA3.1和含有U6啟動子的慢病毒RNA 干擾載體psiHIVU6，構(gòu)建pcDNA3.1-Salusin-α-EGFP 質(zhì)粒和psi-HIV-U6-Salusin-α質(zhì)粒，擴增、純化鑒定，存儲備用。psiHIV-U6-Salusin-α的干擾靶序列為5’-TCC GGC ACT GCG TGC TCA A-3’。按試劑盒說明書包裝psiHIV-U6-Salusin-α質(zhì)粒，收集病毒顆粒備用。

1.2.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染與分組：將VSMCs懸浮于含15%胎牛血清（FBS）的DMEM 培養(yǎng)液中，分裝于直徑為60mm 培養(yǎng)皿中，加入oxLDL（20ug／ml）誘導(dǎo)試劑，37℃，5%CO2培養(yǎng)。待細胞生長密度達到70%，按照細胞克隆篩選法［7］用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染兩種質(zhì)粒入VSMCs，繼續(xù)培養(yǎng)48h，提取蛋白備用，蛋白提取按照Western-blotting試劑盒說明書進行。對照組分為：C0組：培養(yǎng)VSMCs，不作任何處理；C1組：轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-EGFP 質(zhì)粒，培養(yǎng)VSMCs；C2組：轉(zhuǎn)染psiHIV-U6質(zhì)粒，培養(yǎng)VSMCs；C3組：同時轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-EGFP質(zhì)粒和psiHIV-U6質(zhì)粒（兩者比例為1∶1），培養(yǎng)VSMCs。實驗組分為：P1組：轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Salusin-α-EGFP質(zhì)粒，培養(yǎng)VSMCs；P2組：轉(zhuǎn)染psiHIV-U6-Salusin-α質(zhì)粒，培養(yǎng)VSMCs；P3組：同時轉(zhuǎn) 染pcDNA3.1-Salusin-α-EGFP 質(zhì) 粒和psiHIV-U6-Salusin-α質(zhì)粒（兩者比例為1∶1），培養(yǎng)VSMCs。

1.2.3 VSMCs的Salusin-α、ACAT1和SA-R 蛋白表達分析：將提取的各組蛋白進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）［7］，將電泳完畢后的凝膠和聚偏二氟乙烯（PVDF）膜于300mA 恒電流下轉(zhuǎn)移1h后。凝膠用考馬斯亮蘭染色，以判斷轉(zhuǎn)移效率，PVDF 膜于37℃封閉1h，加入一抗，室溫孵育1h，洗膜，加入二抗，室溫孵育1h，洗膜，加入HRPDAB底物顯色。用ZF-368型全自動凝膠圖像分析儀（上海金鵬分析儀器有限公司）分析各蛋白條帶與β-actin的灰度比值，所有測試重復(fù)三次取均值以表示各組Salusin-α、ACAT1和SA-R 蛋白表達，并比較組間差異。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件。計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間均數(shù)比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 pcDNA3.1-Salusin-α-EGFP 和psiHIV-U6-Salusin-α質(zhì)粒鑒定

pcDNA3.1-Salusin-α-EGFP和psiHIV-U6-Salusin-α質(zhì)粒經(jīng)雙酶切和菌落PCR 初步鑒定正確后進行測序，測序結(jié)果與GenBank公布的序列NM＿001134430.2一致。

2.2 轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Salusin-α-EGFP 和psiHIVU6-Salusin-α各組Salusin-α、ACAT1和SA-R 蛋白表達

P1組Salusin-α蛋白表達高于C0組和C1組（P均＜0.01），C0組和C1組無顯著性差異（P＞0.05）。P1組ACAT1蛋白表達低于C0組和C1組（P均＜0.01），C0組和C1組無顯著性差異（P＞0.05）。SA-R 蛋白表達在C0、C1、P1組中的表達均無顯著性差異（P＞0.05）。P2組Salusin-α表達低于C0組和C2組（P均＜0.01），C0組和C2組無顯著性差異（P＞0.05）。P2組ACAT1表達高于C0組和C2組（P均＜0.01），C0組和C2組無顯著性差異（P＞0.05）。SA-R 在C0、C2、P2組中的表達均無顯著性差異（P ＞0.05）。P3組Salusin-α、ACAT1和SA-R表達與C0組和C3組比較，結(jié)果均無顯著性差異（P＞0.05）。各組具體結(jié)果見圖1和表1。

表1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染各組Salusin-α、ACAT1和SA-R蛋白表達（灰度比值，±s，n均=3）

表1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染各組Salusin-α、ACAT1和SA-R蛋白表達（灰度比值，±s，n均=3）

注：與C0組和C1組比較，1）P＜0.01；與C0組和C2組比較，2）P＜0.01

圖1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染各組Salusin-α、ACAT1和SA-R蛋白電泳結(jié)果

3 討論

最新研究表明Salusin-α水平與AS 嚴重程度有關(guān)［8］。AS始發(fā)于血管內(nèi)膜損傷處之巨噬細胞與平滑肌細胞的泡沫化，ACAT1和SA-R 在泡沫細胞的形成中有著重要作用［9，10］。ACAT1是AS 的正調(diào)節(jié)因子，催化游離膽固醇與長鏈脂肪酸合成膽固醇酯，其表達上調(diào)會導(dǎo)致膽固醇酯合成增加而產(chǎn)生泡沫細胞，加速血管壁AS斑塊形成［2，3］。SA-R 作為與修飾LDL結(jié)合的一系列跨膜蛋白，可介導(dǎo)下內(nèi)皮細胞攝入修飾LDL，最終促進動脈壁內(nèi)泡沫細胞和AS斑塊形成［11］。

轉(zhuǎn)基因干預(yù)動脈內(nèi)皮細胞泡沫化是抑制AS進程的一種理想方法。本研究發(fā)現(xiàn)將Salusin-α基因轉(zhuǎn)染至oxLDL誘導(dǎo)培養(yǎng)的VSMCs，其Salusin-α表達增加，促脂質(zhì)化因子ACAT1表達降低，提示Salusin-α可抑制ACAT1表達。而將psiHIV-U6-Salusin-α轉(zhuǎn)染VSMCs，其Salusin-α表達明顯降低，ACAT1表達顯著增加。但同時轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Salusin-α-EGFP 和psiHIV-U6-Salusin-α至VSMCs，則Salusin-α表達和SA-R 表達均無明顯變化。這些結(jié)果表明轉(zhuǎn)染Salusin-α RNA 干擾質(zhì)粒的VSMCs，Salusin-α表達受到抑制，可導(dǎo)致ACAT1表達增加，而Salusin-α表達增加的 VSMCs，ACAT1表達降低。這說明Salusin-α可能通過下調(diào)ACAT1的表達，抑制泡沫細胞形成，進而抑制AS的發(fā)生，其具體機制尚待進一步研究。有學(xué)者［3，6］報道，ACS患者血清Salusin-α水平降低，AS加重，反之AS減輕，與本文結(jié)論一致。本研究結(jié)果還顯示，無論Salusin-α表達增加或降低，SA-R 表達均無明顯變化，說明Salusin-α對SA-R 表達沒有影響。SA-R 促進VSMCs脂質(zhì)化、泡沫化途徑可能與Salusin-α沒有直接關(guān)系。

綜上所述，本實驗研究初步揭示了Salusin-α可下調(diào)促脂質(zhì)化因子ACAT1表達，可能具有抑制AS的作用，或成為防治AS的新靶點。

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6 Watanabe T，Suguro T，SatoK，et al.Serum Salusin-αlevels are decreased and correlated negatively with carotid atherosclerosis in essential hypertensive patients［J］.Hypertens Res，2008，31（3）：463～468.

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10 Hendrickx DA，Koning N，Schuurman KG，et al.Selective upregulation of scavenger receptors in and around demyelinating areas in multiple sclerosis［J］.J Neuropathol Exp Neurol，2013，72（2）：106～118.

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