白偉偉 趙林雙 劉 曄 譚學(xué)瑩

糖尿病腎?。―iabetic Nephropathy，DN）是糖尿?。―iabetes Mellitus，DM）常見的微血管并發(fā)癥之一，20%～30%的1型或2型DM患者并發(fā)DN，其中一部分進(jìn)展為終末期腎?。‥nd Stage Renal Disease，ESRD）［1］。近期研究［2］表明，早期發(fā)現(xiàn)和診斷DN，進(jìn)而采取綜合干預(yù)保護(hù)措施，可以延緩和改善腎臟病變的進(jìn)展，提高DM患者的生命質(zhì)量，延長壽命。目前，DN的發(fā)病原因也是DM領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)問題。G蛋白偶聯(lián)受體（G protein Coupled Receptor，GPCR），尤其是抗血管緊張素II 1型受體（AT1受體）是涉及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞膜受體中最大的家族，它們介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)十分廣泛，包括調(diào)節(jié)腎臟功能和免疫應(yīng)答［3］。近年來，有臨床研究發(fā)現(xiàn)腎損害患者血清中存在針對機(jī)體心血管調(diào)節(jié)受體的自身抗體，尤其是抗GPCR的自身抗體，且其水平變化與血肌酐（Scr）有關(guān)，故推測該抗體可能是DM合并腎損害的重要因素之一［4］。但迄今未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究通過檢測分析血清抗血管緊張素II 1型受體自身抗體（Autoantibodies Against the Angiotensin II Type 1Receptor，AT1－AA）陽性DM大鼠24h尿白蛋白排泄率（UPE）、血尿素氮（BUN）、Scr水平變化，進(jìn)一步探討 AT1－AA與腎損害的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

Wistar大鼠36只，雄性，體重160～170g，由武漢大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 主要試劑

鏈脲佐菌素（Streptozotosin，STZ）為美國Sigma公司出品；血糖、BUN、Scr檢測試劑盒由南京建成生物工程研究所生產(chǎn)；尿白蛋白檢測試劑盒購自北京市福瑞生物工程公司。

1.3 DM模型的建立

36只Wistar大鼠購入并適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)選取29只用于復(fù)制DM模型組（DM組），余7只作為對照組（N組）。DM組大鼠以高糖高脂飼料（常規(guī)飼料加10%蔗糖、10%豬油、2.5%膽固醇）喂養(yǎng)，N組按常規(guī)飼料（蛋白質(zhì)31.1%、脂肪7.79%，其它61.11%）喂養(yǎng)，飼料均由廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。高糖高脂飼料喂養(yǎng)4周，禁食12h后，DM組大鼠腹腔注射STZ 30mg／Kg（臨用前以0.1mmol／L、pH4.3的枸櫞酸緩沖液配制成20g／L溶液）。N組平行注射等量枸櫞酸緩沖液。72h后取尾靜脈血測定空腹血糖，以血糖≥16.7mmol／L為造模成功［5］。DM 組大鼠全部造模成功。DM組造模成功后改為普食喂養(yǎng)，并檢測以下指標(biāo)。

1.4 指標(biāo)測定

1.4.1 標(biāo)本采集：每2周從大鼠尾尖采血測血糖（氧化酶法）。實(shí)驗(yàn)結(jié)束前一日清晨7∶00，將大鼠轉(zhuǎn)入代謝籠內(nèi)，收集24h尿液用于測定UPE（加甲苯酸防腐，混勻后記錄尿量）。于實(shí)驗(yàn)第20周末水合氯醛麻醉下處死動物，斷頭取血3ml，離心后取血清測定AT1－AA和其它腎功能指標(biāo)。

1.4.2 AT1－AA 檢測：（1）自備 AT1：采用多肽自動合成儀（SHIMADZU PSSM－8，Shimadzu公司，日本）合成AT1受體，選擇具有抗原決定簇的細(xì)胞外第二環(huán)多肽作為抗原，即AT1受體第165～191位氨基酸殘基片段（序列：I－H－R－N－V－Y－F－I－E－N－TN－I－T－V－C－A－F－Y－E－S－R－N－S－T－L）。（2）ELISA 檢測 AT1－AA：按照本實(shí)驗(yàn)室建立的方法［6，7］檢測AT1－AA。以蒸餾水為空白對照，供測OD值時調(diào)零。以健康鼠血清為陰性對照，以O(shè)D值超出健康鼠兩倍標(biāo)準(zhǔn)差的DM鼠血清為陽性對照。待測血清與陰性對照血清的OD值之比（待測標(biāo)本OD值－空白對照OD值）／（陰性對照OD值－空白對照OD值）＞2.1判為 AT1－AA陽性。

1.4.3 生化指標(biāo)測定：采用放射免疫法（按照說明書）檢測24hUPE。BUN、Scr水平使用美國BECKMAN SYN CHRON－LX20全自動生化分析儀和配套試劑（苦味酸法）檢測。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（s）表示，兩組均數(shù)比較用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用百分?jǐn)?shù)表示，兩組間比較用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 DM大鼠血糖變化

注射STZ后，DM組大鼠血糖水平（20.36±2.13mmol／L）較 N 組（5.64±0.86mmol／L）明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），并且一直維持在較高水平，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

2.2 DM組和N組大鼠AT1－AA陽性率比較

DM 組 大 鼠 AT1－AA 陽 性 率 為 37.93%（11／29），高于 N 組28.57%（2／7），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 A組和B組大鼠腎功能指標(biāo)變化

DM組大鼠分布于A組11只，分布于B組18只。A組大鼠BUN、Scr、UPE顯著高于B組（P＜0.01），提示AT1－AA與腎損害有關(guān)。見表1。

表1 A組和B組大鼠腎功能指標(biāo)檢測結(jié)果（s）

表1 A組和B組大鼠腎功能指標(biāo)檢測結(jié)果（s）

注：與B組比較，1）P＜0.01

組 別 n BUN（mmol／L）Scr（mmol／L）UPE（mg／24h）A組 11 26.35±5.871） 196.24±23.621） 168.93±10.221）B組18 19.57±3.41 124.26±9.93 131.16±11.38

3 討 論

AT1－AA在多種疾病的發(fā)生、發(fā)展中都起著重要的作用，國內(nèi)外的臨床研究先后在惡性高血壓、先兆子癇等患者血清中檢測到 AT1－AA［8］。Dragun等［9］報(bào)道在33例難治性血管性排斥反應(yīng)的腎移植患者中，16例存在惡性高血壓，在這16例患者中檢測到了針對AT1受體的IgG抗體。本課題組前期研究［4］已發(fā)現(xiàn)，DN 與 AT1－AA 有關(guān)，且針對 AT1－AA的靶向治療能夠提高降壓和減少蛋白尿的臨床療效，可延緩腎功能惡化進(jìn)展。

本文結(jié)果顯示，在29只DM大鼠中，AT1－AA陽性率達(dá)37.93%，N組的陽性率為28.57%，DM組高于N組，提示DM腎損害的發(fā)生可能與AT1－AA有關(guān)，進(jìn)一步對比分析AT1－AA陽性和陰性DM 大鼠24hUPE、BUN、Scr水平發(fā)現(xiàn)，AT1－AA陽性大鼠腎功能較AT1－AA陰性大鼠更差，表明DM腎損害與AT1－AA有關(guān)。這一結(jié)果支持了AT1－AA參與DN的發(fā)病機(jī)制的推測。

AT1－AA參與DM腎損害的可能機(jī)制：GPCR在受到刺激后進(jìn)入胞漿，發(fā)生內(nèi)化、降解、融合、轉(zhuǎn)移及呈遞給相應(yīng)的免疫細(xì)胞，AT1受體屬于GPCR結(jié)構(gòu)抗體，具有激動劑樣活性，可反復(fù)刺激誘導(dǎo)自身免疫反應(yīng)，導(dǎo)致機(jī)體組織損傷。DN的腎小球硬化，內(nèi)皮細(xì)胞損害，導(dǎo)致隱蔽抗原暴露，在部分易感人群誘導(dǎo)機(jī)體自身免疫應(yīng)答，可能是GPCR自身抗體產(chǎn)生的途徑［10］。有研究［11］表明，同樣給予高糖喂養(yǎng)8周，AT1－AA陽性孕鼠的后代出現(xiàn)一系列糖脂代謝異常，并符合代謝綜合征的診斷標(biāo)準(zhǔn)，與同期對照組相比，其對代謝性疾病的易感性明顯增加。α1與AT1等同屬于GPCR超家族，本研究組前期研究［12］已經(jīng)證實(shí)，DN的發(fā)病與α1受體抗體介導(dǎo)的自身免疫有關(guān)，因而推測AT1－AA在DM腎損害過程中發(fā)揮與其相似的生理作用。

綜上所述，AT1－AA與DM 腎損害的發(fā)生有關(guān)，但是AT1－AA是否為DN發(fā)生的關(guān)鍵因子，或僅是DN嚴(yán)重程度的一個指標(biāo)，還需要更多臨床實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證。進(jìn)一步研究AT1－AA與DN的密切關(guān)系，有助于探討DN發(fā)病機(jī)制及其與免疫學(xué)的關(guān)系，可為DN的臨床治療提供依據(jù)。

1 葉任高.內(nèi)科學(xué)［M］.第5版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2001：798.

2 劉 雯，劉會貞，陳全振，等.糖尿病腎病相關(guān)因素分析［J］.中國糖尿病雜志，2011，19（suppl 6）：428～429.

3 Bansal G，Divietro JA，Kuehn HS，et al.RGS13controls GPCR－evoked responses of human mast cell［J］.Immunol，2008，181（11）：7 882～7 890.

4 趙林雙，向光大，廖玉華，等.慢性腎小球腎炎患者血清抗α1受體和血管緊張素II 1型受體自身抗體與腎損害程度的分析［J］.華南國防醫(yī)學(xué)雜志，2009，23（1）：43～49.

5 Brownlee M.Biochemistry and molecular cell biology of diabetic complications［J］.Nature，2001，414（13）：813～820.

6 苑海濤，廖玉華，王 敏，等.系列抗心肌多肽自身抗體對擴(kuò)張型心肌病的診斷價值［J］.臨床心血管病雜志，2000，16（7）：313～315.

7 Liao YH，Wei YM，Wang M，et al.Autoantibodies against AT1－receptorand a1－adren ergicreceptor in patients with hyper－tension［J］.Hypertens Res，2002，25（4）：641～644.

8 Fu ML，Herlitz H，Schulze W，et al.Autoantibodies against the angiotensin receptor（AT1）in patients with hypertension.J Hypertens［J］.2000，18（7）：945～953.

9 Draun D，Muller DN，Brasen JH，et al.Angiotensin II type 1－receptor activating antibodies in renal－allograft rejection［J］.N Eng J Med，2005，352（6）：558～569.

10 Ralf Dechend，Volker Homuth，Gerd Wallukat，et al.Agonistic directed at the angiotensin II AT1recrptor in preeclampsia［J］.J Soc Gyencol Investig，2006，13（2）：79～86.

11 張 熙，張?zhí)K麗，楊光照，等.AT1抗體陽性孕鼠后代對代謝性疾病的易感性增加［J］.中國病理生理雜志，2010，26（10）：2 056～2 057.

12 劉 曄，趙林雙，李德忠.α1－腎上腺素受體抗體介導(dǎo)對糖尿病大鼠腎小管TGF－β1表達(dá)的影響［J］.微循環(huán)學(xué)雜志，2012，22（1）：10～12.